生物基因體以 DNA 的形式攜帶遺傳訊息，生物會選擇性地擷取特定 DNA 片段，將其轉錄成 RNA，再將 RNA 轉譯成蛋白質。而具有生理功能的蛋白質則在生物體中進行著各式各樣的反應，維持生物體的生理機能。由此可知，蛋白質對於生物體的重要性。
但是大家是否知道，在如同茫茫大海的基因體中，蛋白質是如何從 RNA 中被定義出來的呢？答案是：生物資訊學家在訊息 RNA 上尋找起始密碼子 AUG 與其相互距離最遠的終止密碼子（UAG、 UAA、UGA），來定義蛋白質的轉譯區間，且此轉譯區間必須大於一百個胺基酸，而且區間之間不可以相互重疊（圖一A）。
然而，生物體是否真的按照科學家所定義之區間產生典型的蛋白質呢？亦或是如同訊息 RNA 一樣會有選擇性轉錄作用的發生？另外，起始密碼子一定會是 AUG 嗎？如果真的有跟目前定義不同的非典型蛋白質產生，它們是否具有生理功能與意義呢？關於蛋白質的定義，還有許許多多的疑惑困擾著科學家們，今天就讓我們一起徜徉在基因體海洋中，揭開蛋白質的神秘面紗吧！
藏寶圖：利用核醣體定序分析技術找出轉譯起始點
想要在汪洋大海中尋寶，若能有藏寶圖想必能事半功倍。
在 2009 年以來，Ingolia 與 Gao 博士為主的科學家們，建立核醣體定序分析技術，利用「lactimidomycin（LTM）轉譯抑制劑」，抑制轉譯作用在剛起始的階段，讓核醣體累積在訊息 RNA 上的轉譯起始位置，再搭配「puromycin（PMY）轉譯抑制劑」，將已經進入轉譯延長階段的核醣體解開，讓核醣體只能佔據在轉譯起始位置，最後再透過 RNA 定序找出核醣體所佔據的轉譯起始序列（圖一B）。「cycloheximide（CHX）」則為另一種轉錄抑制劑，可以將轉譯作用抑制在剛起始及已經進入轉譯延長階段的核醣體，可以幫助我們定義出整體的轉譯區間（圖一C）。經由 LTM 與 CHX 兩者訊號比較，可以讓我們更準確的定義訊息 RNA 上的轉譯起始點與轉譯區間。
透過核醣體定序分析技術，科學家們發現，在哺乳類動物細胞中，有許多轉譯起始點並不位於典型定義的起始位置，而且，除了起始於 AUG 密碼子之外，也會起始於跟 AUG 相差一個核酸的密碼子，像是 CUG、ACG 等等。此外，轉譯起始點的位置，不只會位於傳統認知的編碼區，還會位於 5 端與 3 端非編碼區。
最重要的是，這些非典型起始位置所轉譯的蛋白質，在生物體中確實會表現出來，並且具有生理功能。例如：促進癌症細胞生長的「FGF2（fibroblast growth factor2）基因」與抑制癌症細胞生長的「c-myc 基因」，皆具有一個位在 5 端非編碼區的 CUG 非典型轉譯起始點，並且會轉譯出與典型蛋白質功能相異的蛋白質異構體。
有趣的是，外在環境的刺激會改變轉譯起始位置，進而轉譯出功能相異的蛋白質。以「MRPL18 基因」為例，當細胞處在正常環境時，MRPL18 會使用典型 AUG 起始點轉譯蛋白質，並且蛋白質會被傳送到粒腺體內組成核醣體，進而幫助蛋白質的合成。但是，若細胞處在高溫逆境中，MRPL18 基因則會使用下游非典型轉譯起始點 CUG 轉譯蛋白質，並將此非典型轉譯蛋白質送至細胞質組成特殊形態的核醣體，用來幫助轉譯 HSP70 熱休克蛋白，進而幫助細胞維持體內環境的穩定並抵抗高溫逆境。
綜合以上的結果，有了核醣體定序分析技術這張藏寶圖，我們發現了一片有別以往認知的新大陸，對於生物體的生理機制與基因轉譯的調控，有了更進一步的認識。
▲圖一：核醣體定序分析技術，幫助定位轉譯起始點。
植物航道中的大秘寶
由於植物無法移動的特性，因此，相對於動物而言，植物更需要透過調控自身蛋白質表現，來因應外在環境的刺激，用以維持生理的穩定。
劉明容博士實驗室於 2020 年透過核醣體定序分析技術，在番茄與阿拉伯芥中，發現超過 50% 的轉譯區間起始於非典型定義位置。如同動物一樣，植物轉譯起始密碼子，可以起始於與 AUG 相差一個核酸的密碼子，例如 CUG 與 ACG，並且發現轉譯起始位置分布於 RNA 的各個位置（5 端非轉譯區、轉譯區、3 端非轉譯區）。另外也發現在有些訊息 RNA 上，透過不同轉譯起始點所產生的蛋白質，表現於不同位置。這樣的研究結果可能代表著，不同轉譯起始點所轉譯的蛋白質，具有不同的生理功能。
另一方面，對於植物而言，植物病毒的入侵將嚴重地影響到作物的產量與質量。因此，若能完整地定義出植物病毒的蛋白質，將有助於植物在抵抗病毒上的應用與發展。以「番茄黃化捲葉病毒（TYLCTHV, genus Begomovirus）」為例，其為單股 DNA 病毒，在其 DNA-A 及 DNA-B 基因體上，各具有六個（AV1、AV2、AC1-AC4）及兩個（BV1、BC1）原始定義基因。這些基因所轉譯出來的蛋白質，在病毒感染植物宿主的過程中，扮演著重要的角色。
透過核醣體定序分析，研究團隊更進一步發現額外 17 個起始於 AUG 與非 AUG 的非典型轉譯起始點，並發現一直以來，對於 AV2 與 BV1 基因的轉譯起始位置，定義是錯誤的，將原始定義之轉譯起始點突變，並不會影響到病毒的致病性；反之，若將新找到的非典型轉譯起始點突變，會抑制 AV2 與 BV1 蛋白質表現，進而降低病毒的致病性。
此外，研究團隊也找到一個尚未被發現的非典型轉譯起始點，其可轉譯出 BV2 蛋白質，並且轉譯區間被隱藏在 BV1 的轉譯區間內，將此非典型轉譯起始點突變會影響到病毒的致病性。基於 BV2 蛋白質分布在細胞的內質網與原生質絲，而內質網與原生質絲是病毒複製及病毒粒在細胞間傳播的必經之地，因而推測 BV2 蛋白質可能參與在這兩項病毒的生理過程，進而幫助病毒在宿主中，完成完整的生命週期。
綜合以上結果，我們可以得知藏寶圖也適用於植物與植物病毒這兩個領域，用來探索非典型轉譯蛋白質的位置。此外，植物與植物病毒的非典型轉譯蛋白質皆具有生理功能。由此可見，生物體藉此增加蛋白質的調控與組成的多樣性，用來維持體內的恆定，抵抗外在的環境刺激。
寶藏的由來?
透過核醣體定序分析技術，我們找到了許多非典型轉譯蛋白。但是，關於生物體如何辨認、決定、甚至如何調控轉譯起始點，至今仍不清楚。若能更進一步地釐清轉譯起始點的調控機制，將有助於瞭解生物體內的運作情形，進而提升生物體抵抗外界刺激，維持體內恆定的能力。
目前針對辨認轉譯起始點的研究方向，主要著重在特定的 RNA 序列與轉譯起始複合體（preinitiation complex；PIC）兩大主軸（圖二）。在特定的 RNA 序列上，Kozak 博士提出的 Kozak 序列，指出在起始位置前方的第三個核酸是 A 或 G，而後方第四個位置是 G，將會有效地提升核醣體與轉譯起始點的結合，進而提升轉譯效率。此外，在動物細胞中也發現，一連串的 GGGGCC 重複性序列會造成核醣體直接進行轉譯作用，產生非典型轉譯蛋白質，並發現其與生物體神經方面的疾病有關，像是一般較為人熟知的漸凍人症狀等等。
另一方面，轉譯起始複合體被發現參與在轉譯起始點的辨認上。其中，由 eIF4A、eIF4E、eIF4G 次單元所組成的 eIF4F 複合體，負責結合到要進行轉譯的 RNA 上，然後招來由 eIF1、eIF1A、eIF2、eIF3、eIF5 次單元所組成的轉譯起始複合體，在 RNA 序列上進行掃描與辨認起始密碼子，進而進行蛋白質的轉譯（圖二）。有研究指出，大量表現 eIF1 次單元可以有效地提升由 AUG 起始密碼子所進行的轉譯作用，而與 eIF2 次單元相似的 eIF2A 與 eIF2D 次單元，則參與在由非 AUG 起始密碼子所進行的轉譯作用中。
▲圖二：調控轉譯起始點的兩大方向：特定 RNA 序列與轉譯起始複合體。
神秘面紗只揭開了一角
關於轉譯起始點的調控機制，其實尚未釐清，在特定的 RNA 序列上，除了 Kozak 序列外，是否還有其他特殊的序列與轉譯起始點的辨識有關，或是否具有專屬於特定轉譯起始密碼子的 RNA 序列，抑或是，是否具有專屬於特定環境刺激所辨認的 RNA 序列，這些疑問都尚待進一步的分析。在轉譯起始複合體的部分，在不同的環境刺激中，是否會引起不同的次單元表現，進而影響轉譯起始點的選擇呢？
另外，轉譯起始複合體中的次單元究竟是如何影響到轉譯起始點的選擇？除了上述所提到會影響到轉譯起始點選擇的次單元外，其他次單元是否也參與其中？而非典型轉譯蛋白質在各種生理反應中又扮演著什麼樣的角色呢？在探索非典型轉譯蛋白質的功能上，我們任重道遠。
期望未來能破解上述問題，得到的答案應可促使我們更加清楚生物體如何調控蛋白質的轉譯，以及對於現存許多棘手的農作物逆境困境及病害上，提供更好的解藥。除此之外，目前關於非典型轉譯蛋白質的研究，大多集中在哺乳類動物與酵母菌中，在植物及其他農作物是否利用相同的調控機制，或是具有獨特的調控路徑都值得我們去探討，尤其是在糧食作物上，其將有助於幫助植物抵抗目前多變的環境刺激，進而解決糧食危機。
延伸閱讀
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