蛋白質是基因表現的終產物，生物體內進行反應多以蛋白質為主，而非DNA或RNA，所以要了解生命的奧秘，必須要對蛋白質有深入地了解。此外，臨床用藥物也是透過與蛋白質結合，來達到治療的目的，因此蛋白質研究對明瞭藥物的活性與新藥的開發極為重要。

        研究蛋白質的主要技術瓶頸，是如何取得量足質純的蛋白。目前最常用的方法是基因重組技術，先建構欲表達標的蛋白的載體，將載體送入寄主細胞，後者會誤認載體上的標的蛋白基因為自己的基因，大量表達出標的蛋白，然後經純化步驟取得標的蛋白。目前相關技術已高度發展，幾乎達到人人皆可做的簡易程度。可惜，在實際操作時，結果經常不如預期。蛋白質依物理特性可分水溶性與脂溶性兩類。脂溶性蛋白必須嵌鑲於油性的細胞外膜或各種胞器膜，由於細胞裡膜的總表面積有限，大量表達時，多數脂溶性蛋白無法進入膜內，經疏水性作用，相聚成無活性的固體團，即所謂「包涵體」。水溶性蛋白，雖不須嵌於膜內，大量表達時，也常形成包涵體。相關研究顯示，高達80％所謂的水溶性蛋白，不易大量表達成能溶於水的重組蛋白，這是現代生物與生物科技重要課題之一。

        解決上述問題，方法之一是融合蛋白技術（Fusion Protein Approach）。此方法係將攜帶蛋白（Carrier）的基因與標的蛋白的基因，以基因重組技術結合為一，表達出「攜帶蛋白+標的蛋白」前後接合的融合蛋白。融合蛋白因攜帶蛋白的加持輔助，表現量與水溶性都可增加。融合蛋白在設計時，會在攜帶蛋白與標的蛋白間，加入一段特別的氨基酸序列，可被蛋白水解酶專一性的辨認與切割，達到分離兩者的目的，再經一輪純化步驟，即可取得標的蛋白。由過去許多生化學者實驗經驗得知，同一攜帶蛋白對不同的標的蛋白，效果有很大差異。目前有十幾種不同的攜帶蛋白可供選擇，因此對同一標的蛋白而言，比較保險的辦法就是多試幾個不同的攜帶蛋白。要做到這點很容易，只需將標的蛋白基因，利用重組基因方法，分別置入含有不同攜帶蛋白的載體即可。可是當實際要同步選殖載體時，經常先要花一番功夫選擇適當的限制酶，去切割不同載體與標的蛋白的DNA，然後才能進行基因重組工作。為了免除選擇限制酶的繁瑣，筆者發明一個新方法，只用兩個任意選定的限制酶（如EcoRI與XhoI），應用非平整端點聚合酶連鎖反應（Sticky-End PCR），將任何標的蛋白基因的兩端，分別製出EcoRI或XhoI之非平整端點（圖1A），再以固定方向，同步置入不同載體。此新方法的原理與步驟都很簡單，很快就在實驗室驗證成功，並建立了高效率水溶性蛋白質篩選技術平台，於2002年發表在Protein Science期刊。

圖1、非平整端點聚合酶連鎖反應應用於基因重組方法。（A）利用兩對引子分別進行兩個聚合酶連鎖反應，然後將兩個產物等量混合，DNA的5’端利用T4多核苷酸激酶加以磷酸化，95oC加熱5分鐘，使雙股DNA分離成單股DNA，65oC靜置5分鐘，使單股DNA又回復成雙股DNA。結果會有25％雙股DNA，其兩端分別產生EcoRI與XhoI的非平整端點，可直接與載體進行接合。（B）如（A）所述，因SnaBI切割出平整端點，依圖完成反應步驟後，有50％雙股DNA，一端有SnaBI的平整端點，另一端是XhoI的非平整端點。P2、P1與P1’代表氨基酸位置，詳細解釋見圖2。

        由於此法適用於任何基因，本所王惠鈞所長將其納入國科會所補助的高效率蛋白質X光結構核心實驗室計畫中。後來，基因體計畫辦公室建議王所長將此新技術另外成立高效率蛋白質表達核心實驗室。三年多來，該核心實驗室服務過國內數十個實驗室，完成近三百件水溶性蛋白質篩選工作，其中幾個實驗室已發表相關成果。我們也透過技術轉移方式，在國內外推廣此技術平台，國內目前有超過40個實驗室或研究機構接受技轉，國外技轉對象包括芝加哥大學、紐約大學、丹麥Aarhus大學、荷蘭Groningen大學、日本東京大學等數個實驗室。去年我們也受邀為美國冷泉港實驗室所出版的蛋白質體學技術專書，撰寫一章專文，更詳細說明此技術的設計與操作流程。

        雖然以上方法可快速篩選能產生大量水溶性蛋白的載體，本質上仍無法避免融合蛋白技術既有的缺失。該方法過程冗長且昂貴，要先純化融合蛋白，然後用昂貴的蛋白水解酶將融合蛋白切開，再經第二輪蛋白質純化步驟，才取得標的蛋白。有些標的蛋白一旦與攜帶蛋白分離後，立刻失去水溶性發生沈殿，因而前功盡棄。另一個大問題是融合蛋白經水解酶切割後，產物常會比原態蛋白多出幾個額外的氨基酸。後者形成原因，是因必須於標的蛋白與攜帶蛋白基因間，外加入限制酶與蛋白質水解酶所能辨識的特定序列。這些多出來的氨基酸，有些會影響標的蛋白的生化活性或結構穩定性，即便對兩者都沒有影響，也大大降低了該蛋白之應用價值。因為臨床用的蛋白質藥或製劑，基本要求之一，就是其氨基酸序列與組成必須與原態蛋白完全相同，否則就得大費周章地提出生理與病理研究數據，證明多出來的氨基酸對人體無害，也不會發生免疫排斥等問題。基於以上考量，融合蛋白技術過去在生技工業並不受青睞。

        在本所王所長支持下，我們最近成功研發出一套新技術，可改善上述缺失。此方法是在寄主細胞內，同時表達融合蛋白與煙草蝕刻病毒蛋白水解酶（tobacco etch virus protease，簡稱TEVP），TEVP可直接在細胞內切割融合蛋白，因此無需經過任何純化步驟，即可檢驗標的蛋白的表現量與水溶性。這項新技術，仍採用非平整端點聚合酶連鎖反應的方法，只用兩個特定的限制酶（SnaBI與XhoI；圖1B），就可將任何標的蛋白的基因平行選殖入多個不同載體。SnaBI限制酶的選用是非常別出心裁的設計，結果能使產出的標的蛋白，不僅完全沒有多出任何氨基酸序列（即原態蛋白），也可依需求隨意改變前幾個氨基酸序列。此系統另一個優點是，可應用在多種寄主細胞，如大腸桿菌、酵母菌與動物細胞均可，因為TEVP在這些細胞表達後，都有活性。實際應用時，可以trans或cis兩種方式進行，前者是在寄主細胞表達「攜帶蛋白-rsTEV-標的蛋白」與TEVP兩個蛋白，rsTEV代表TEVP所辨識切割的特定氨基酸序列（圖2A）。cis方法則表達一個較長的融合蛋白（攜帶蛋白-TEVP-rsTEV-標的蛋白），然後TEVP可進行分子內或分子間切割反應，製造出原態蛋白(圖2B)。

圖2、Trans 與Cis 兩種方法的簡易示意圖。（A）Trans方法是在同一細胞內產生“攜帶蛋白-reTEV-標的蛋白”與TEVP兩個蛋白，TEVP辨識rsTEV序列，由右而左依序命名為P1-P6。Z代表標的蛋白的第一個氨基酸，位置以P1’代表，可由20種氨基酸中任意選其一。TEVP切割位置位於P1與P1’間。Tyrosine (Y)與Valine (V)兩個氨基酸的遺傳密碼合起來即是SnaBI限制酶所辨認的DNA序列。（B）Cis方法是在同一細胞內產生一個「攜帶蛋白-TEVP-rsTEV-標的蛋白」的融合蛋白，然後TEVP可進行分子內或分子間反應，將標的蛋白切出來。P1與P2代表控制基因表現的啟動子。

        上述創新的技術，不僅成功改進融合蛋白技術的缺點，又因不需購買昂貴的蛋白質水解酵素，可大幅降低其成本，因此對蛋白質研究或工業生產都會有用。目前本技術已獲得本院審核通過，申請專利中；論文也於今年五月發表於Protein Science期刊。值得欣慰的是，立刻受到不少國外研究人員的重視，來函尋求合作或技術轉移。短短一個月期間，已同意技術移轉給以色列耶路撒冷市的猶太大學、奧地利Paris Lodron大學、瑞士蘇黎世大學等研究機構，對提升本院國際知名度將會有助益。

參考文獻：（*corresponding author）

1. Yan-Ping Shih, Wen-Mei Kung, Jui-Chuan Chen, Chia-Hui Yeh, Andrew H.-J. Wang and Ting-Fang Wang* (2002) High throughput screening of soluble recombinant proteins. Protein Science 11, 1714-1719.
2. Ting-Fang Wang* and Andrew H.-J. Wang (2004) High-throughput screening of soluble recombinant proteins. Chapter 5 of “Purifying Proteins for Proteomics: A Laboratory Manual” edited by Richard J. Simpson, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
3. Yan-Ping Shih, Hui-Chung Wu, Su-Ming Hu, Ting-Fang Wang* and Andrew H.-J. Wang* (2005) Self-cleavage of fusion protein in vivo using TEV protease to yield native. Protein Science 14, 936-941.

註：本文由生化所助研究員王廷方撰稿，特聘研究員兼所長王惠鈞院士校稿。
專業用語之中英翻譯，請參閱王惠鈞院士總校閱之《生化實驗—基礎操作原理與方法》（2005年，偉明圖書有限公司出版）