◆◇專題演講◆◇ 二分藉智慧、二分天註定、六分靠打拼：研究乙烯生合成途徑中的點滴（Ⅲ） （楊祥發院士學習及研究的故事） 楊祥發副院長口述黃裕欽整理 演講時間/地點：七月十六日/植物所106室 我今天想講一些小故事，希望能對正在從事研究工作的人有一點 啟發。 幾千年前，人類已開始在日常生活中使用乙烯，只是那時並不知 是乙烯的作用。乙烯是在最近五十年才被發現是植物的重要賀爾蒙 之一。在上次的演講中，我們已談到乙烯生合成的途徑很短，其中 間產物只有s-腺核甘硫胺酸(SAM)和氨基環丙烷羧酸(ACC)，也就是 ： methionine→SAM→ACC→乙烯 所有的生物都具有一種酵素，可以讓甲硫胺酸(methionine)轉變成 SAM，然而只有植物具備酵素，可以從SAM到 ACC而最後生成乙烯反 應，這是植物特有的代謝反應與途徑。今天要和大家談談由 SAM生 合成 ACC以及從ACC要氧化成乙烯的生化學過程。 ACC的發現與生合成 ▔▔▔▔▔▔▔▔▔ ACC於一九五七年被英國人Burroughs發現。當時它僅是一種存在 於天然界，而不會合成蛋白的「非蛋白質胺基酸」(non-protein amino acid)，並沒有引起科學家注意，一直到一九七九年，我們實 驗室發表ACC是生合成乙烯的中間體後，ACC從默默無聞，成為植物 學研究界的搶手貨。原先製造ACC的Calbiochem公司表示，二十多年 來 ACC化學品沒有什麼人訂貨，不料今天會有連續製作五批次仍被 搶購一空的盛況。 英國人首先發現ACC不是偶然的。我曾開玩笑的問說：「為什麼首 先把ACC從植物中分離、鑑定出來的人是英國人，而不是美國人？」 英國人一向喝的是發酵過且含有酒精的蘋果西打(apple cider)或是 梨子發酵汁(peary)，而美國人喝的是蘋果的榨汁。果汁經過發酵後 ，可以將量多的α-胺基酸(alpha-amino acid)轉化為酮基(keto) 化合物，然後代謝掉。只剩下γ-胺基丁酸(gamma-amino butyric acid)和ACC等非alpha-amino acid的胺基酸，在濾紙層析儀上可以 清楚的看到ACC的藍點(blue spots)。但美國人喝的未發酵的蘋果榨 汁，滴到濾紙層析儀上，則因大量的alpha-amino acid，使得濾紙 形成一片藍色，蓋住量少的ACC，以致無法察覺ACC的存在，所以英 國人比較有可能發現ACC。 話說當時因為ACC頓時非常搶手，不容易買到，於是我們決定自己 從植物中將ACC分離出。原本以為漂白劑(NaOCl)的作用和英國人將 果汁發酵的作用很類似，加漂白劑可以將所有的alpha-amino acid 分解，而得到ACC，沒想到加了漂白劑後，ACC也被吃掉，變成乙烯 。當我的學生Lizada告知我這個意外的結果時，我們不但沒有因為 做不成 ACC感到灰心喪志，反而根據此意外發現，發展出一套定量 溶液中ACC 濃度的方法。實驗證實在ACC溶液中加入一滴漂白劑， ACC馬上轉變成乙烯，乙烯可經由氣相層析儀，在兩分鐘內定量，從 放出的乙烯量，我們可以計算出ACC的含量，其靈敏度高達數個 picomole。(按： picomole = 10-12 mole)。這個方法又稱 為Lizada and Yang's Method，優點是簡單、快速而敏感度高。一 直到現在，大部分的研究者仍沿用此意外發現的方法來測定ACC的含 量，也被SCI列為被引用最多的文獻之一。 從乙烯生合成的整個反應機構來看，不難推測為何ACC的生合成是 需要先經過SAM。其實生物界選擇SAM當作ACC的前驅體是有道理的。 首先，SAM是在動物、植物及微生物普遍存在的化學物。其次，ACC 是一個三角環形的化學物，要產生這樣的化學結構，最可能的來源 是由帶正負電鋸齒狀的碳氫先驅者，經電子「推與拉」合作機構， 就可產生三角環形的化學物，如下圖所示： 而SAM的結構具備有上圖的左邊結構的特徵，只要將alpha-H原子 拿去即可。依據一般生化學的學理要去掉alpha-H原子，最輕易的方 法是藉Vitamin B6即磷酸[口比]哆醛(pyridoxal phosphate)為輔[ 酉每] (coenzyme)來完成。當我們成功地分離ACC合成酵素後，發現 它需要 pyridoxal phosphate作為輔[酉每](coenzyme)，這和我們 的推測完全一樣。此外，SAM的另一特點是它可再生成methionine及 SAM而完成「楊氏循環」。 當我們找到SAM生成ACC的酵素及機理時，感到非常的滿足與快樂 。當然我們也曾做了很多錯誤的預測，得不到結果，好幾個晚上睡 不著，感到非常氣餒。生物化學是一門實驗的學門，不試是不可能 成功的。只有願意花長時間去實驗與工作，才能當一個成功的生化 學家。也唯有多花時間做實驗，經過多次失敗，成功的機會才會跟 著增加。 在明白了ACC生合成的過程之後，我們開始著手研究如何抑止ACC 的合成，以減少乙烯的生成量，進而希望能抑止或減緩植物的成熟 或老化。 我們已知有兩種可抑制磷酸[口比]哆醛(pyridoxal phosphate)作 用的抑制劑(inhibitor)，AVG與AOA，可用以減少ACC的生成。所以 我們就用康乃馨做實驗材料，分別在甲、乙、丙三個花瓶各插了一 朵康乃馨，所不同的是花瓶中的水；甲瓶放的是自來水、乙瓶加入 AVG、而丙瓶則加入AOA。過了二十天後，乙瓶和丙瓶的花朵仍然茂 盛，而甲瓶的花已經凋謝了。使用Lizada & Yang's Method測出， 甲瓶中含 ACC的量比乙瓶及丙瓶高到幾十倍。也由此可知，將AVG或 AOA加入放置康乃馨的水中，可以減緩ACC及乙烯的生成，達到保鮮 的功效。 另一方面，我們利用ACC合成酵素需要pyridoxal phosphate做為 輔[酉每]的特徵，成功地把ACC合成酵素的活性部位(active site) 的胺基酸定序(sequence)出來，然後再基於此胺基酸順列合成相對 的寡核甘酸(oligonucleotide)，用以複製ACC合成酵素的基因。 ACC氧化產生乙烯 ▔▔▔▔▔▔▔▔ 從Lizada & Yang's Method中我們知道漂白劑(NaOCl)和ACC會反 應生成乙烯，其基本原理是將氨(amino)基氯化。所以在一九八四年 時，我們發表了一篇論文，推測在植物體內ACC會產生乙烯的反應與 漂白劑相似，是經氧化酵素將amino基羥(hydroxylation)，而其中 oxene所扮演的角色和漂白劑中的Cl+很像。許多化學反應機構都顯 示，hydroxylation和氯化除了氧化劑(oxidant)不同之外，其作用 有異曲同工之妙。此外，我們以實驗證實ACC在植物體內被氧化生成 乙烯的副產物分別為CO~BB2S1;2及HCN。這些結果支持ACC轉化為乙 烯是經過N-hydroxylation。但當時我們實驗室對於自己的結論並沒 有很大的信心，最重要的原因是我們除了從副產物來間接推測之外 ，沒有任何技術可以直接證實這個羥基化(hydroxylation)的假說。 一直到一九九○年，英國科學家Grierson比較已成熟與未成熟的 蕃茄，發現在成熟的蕃茄中有六個基因是未成熟的蕃茄所沒有的。 後來他們發現了其中的一個基因pTom13是與乙烯生合成的機制有關 ，把其DNA相當的胺基酸序列(amino sequence)找出來，發現和二氫 黃酮 -3-羥基化[酉每](flavanone-3- hydroxylase)的胺基酸序列 很近似。他馬上以傳真告訴我，一九八四年我提出有關ACC產生乙烯 的反應機制是hydroxylation的假說是正確的。 後來英國科學家John收了一位希臘留學生，生化的底子並不強， 但對這個問題很有興趣。延續Grierson的實驗，這位希臘同學到圖 書館去找關於分離及測定flavanone hydroxylase的資料，發現這個 酵素需要Fe2+和抗壞血酸(ascorbate)當協同因子(cofactor)。於是 他就用同樣的這兩個cofactors來展現乙烯生成酵素(EFE)的活性。 很幸運地，他們證實了這個反應的過程需要這些hydroxylation所需 的 cofactors。他很快的做出實驗，並開始寫論文，一年後得到博 士學位，如此想想，他在圖書館好好花二個小時是非常值得的收穫 。 原本以為是很難的實驗，沒想到如此快的被做出來。從一九七九 年知道ACC為中間體，一九八四年提出乙烯生成酵素可能是羥基化[ 酉每] (hydroxylase，一直到一九九一年才被證實。進步如此緩慢 的最主要的原因是我們一直錯誤地以為打破細胞則酵素會被破壞， 而事實上不是酵素被破壞而是cofactors被稀釋，只要加上 cofactors，酵素的活性即可展現。這一個觀念之差，使該項研究的 進展慢了十年。所以我常常告訴我的研究生，想的簡單些、多做些 、多錯些，不要什麼都怕、都不敢做。這時，乙烯生合成的反應機 制已經幾近完全了解。 乙烯可以促使水果的成熟與樹葉的老化 ▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔ 秋天的葉子變紅與凋落其實和乙烯很有關係。乙烯可以導致消化 細胞壁酵素的合成，在枝梗上產生隔絕層，將葉子分離，葉子因而 老化，而後因重力而掉落。 一九八三年我去英國劍橋大學講學的那年，曾經去看三一學院 (Trinity College)庭院前的那棵蘋果樹，據說牛頓曾在此樹下因蘋 果的掉落而發現地心引力。牛頓不是植物學家，不知道只有重力是 不夠的，植物的葉子和果實之所以掉下，是因為體內先生合成乙烯 ，促使葉子和果實與枝梗分離而落下。 中國人幾千年前就知道將點燃的香放入盛有香蕉的容器，可以促 進香蕉的成熟。小時候，朋友解釋說是因為拜拜的關係，我不相信 。後來知道科學家早已證明只要空氣中乙烯的濃度大於千萬分之一 ，就有催熟的功效。也就是說，在密閉容器中因香柱不完全燃燒所 產生的微量乙烯，可促使其中的香蕉成熟，今天這教室中若有人抽 煙，也會有相同的效果。 埃及也早在建造金字塔的時代之前，就知道將少許的橄欖油滴在 無花果上或是把無花果刻痕，以促進果實的長大與成熟。現代的科 學探討結果，知道橄欖油可以氧化生成乙烯，而在無花果上刻痕則 可以刺激合成ACC的基因之活性，而導致ACC與乙烯的生成。這兩種 方法都在金字塔考古研究中被證實。 在西洋的文獻中，Theophrastus於西元前三世紀寫了人類史上第 一本植物學方面的書，名為Inquiring into the Plants。其中記載 在無花果果實上割痕可以在四天內促使果實長大成熟。<<舊約聖經 >> 中的阿摩司書第七章第十四節中，也有如下記載，阿摩司說：「 我不是先知，也不是先知的兒子，我是牧人，又是割裂無花果的人 。」以現代的用詞，我們可以說先知阿摩司是農業生物技術人員， 他用刀割裂無花果，以便誘導ACC合成酵素，進而促進果實長大、成 熟。 施明德先生<<苦難的啟示>>與乙烯 ▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔ 台灣的政治人物施明德先生在一九七五年發表的<<苦難的啟示>> 文章中，曾提到被囚禁在火燒島(綠島)時因缺乏蔬菜，於是在押房 孵豆芽的情形。「在同一批所孵出的豆芽中，有的瘦長，有的粗壯 。經過好幾次觀察，我終於得到一個結論。這和品種無關，凡是生 長在舒適的上層都長的瘦長，被困在下層，負荷最大壓力的則長得 粗壯結實像白武士。」他同時將這種現象引申到人類文明的發展， 認為只有在壓力下，生活不易才會產生文明。他表示，「懂了這個 孵豆芽的原理以後，我就不再為我個人被關在火燒島感到痛苦」。 因為神要給他壓力，好讓他像白武士般強壯，創造人類文明。 施先生這番孵豆芽的感懷，有許多值得現在正從事研究工作的同 學學習。首先他知道要比較「同一批豆芽」，可見他知道做比照 (control)實驗的重要性，我常告訴同學們，只有好的比照實驗，才 能有真確的結論；其次，他的結論是「經過好幾次觀察」所得，是 重覆實驗的結論。有些同學常常僅做了一次實驗，即要馬上發表而 畢業的念頭。施先生以為生活上的壓力是文明開創的原動力，實驗 室中的研究壓力又何嘗不是人類科學創造的源頭。而後我把施先生 的文章翻譯給美國同事聽，並開玩笑地告訴他們，假如當年施先生 拿那篇文章來申請加州大學生物學研究所當研究生，我一定會接受 並給他獎學金。因為我相信以他的苦幹精神及仔細的觀察，一定可 以完成博士學位，並成為一個優秀的生物學者。如果他如此做，或 許不必經過第二次被囚禁的苦難。 幼時也曾聽過母親提及：「小孩的生長就像孵豆芽般，有壓力才 會出頭」等類似的庭訓。於是我決定做一個實驗，以探討壓力對於 豆芽的影響。這個實驗很簡單，找兩個細長的玻璃瓶，分別放入同 樣的土壤及豆芽，唯其中一個玻璃瓶上平擺一張紙，紙上放置少許 土壤與小石頭以增加負荷壓力。實驗結果發現受壓的豆芽果然長的 較為粗、短，且芽頭彎曲向下。根據文獻報告，豆芽受壓後，誘導 乙烯的合成，而如此產生的乙烯可促使植物細胞壁的細微纖維 (microfibril)之生成及放置的方向改變，由橫向轉為直向。以致於 當水分從根部往上輸送時，其芽梗自然向橫膨脹，變得粗壯。此外 ，受到壓力而生成的乙烯，也會促使芽頭彎曲向下。植物就靠這個 機理在受到重大壓時，生成更多乙烯，讓豆芽生成粗壯又芽頭向下 彎曲。這些反應是幼芽能夠從重土鑽出來而生長、生存的原理。如 此，施先生的苦難的啟示，可以追溯到乙烯生合成的機制。知道豆 芽長得「結實又粗壯」的直接原因是乙烯後，豆芽生產者就不再採 用舊式的方法在孵豆芽時以大石頭壓在豆芽上面，而改用新式的乙 烯處理法讓綠豆舒適的生長成為「結實又粗壯」的豆芽。