◆◇專題演講◆◇

  二分藉智慧、二分天註定、六分靠打拼：研究乙烯合成途徑中的點滴(Ⅱ)

      (楊祥發院士學習及研究的故事)

      楊祥發副院長口述  黃裕欽整理
      演講時間/地點：六月十八日	/植物所106室

      研究受到肯定之道

      我覺得一個人無論做什麼事，成功總要具足三個因素：智慧、機
    運(天註定)、及打拼。其中又以打拼最為重要，也是唯一自己可以
    掌控的要素。機運是無法掌控的，而智慧不足還可以怪父母，但是
    不打拼則要自己負責。事實上，科學史上許多重要的發現，是在很
    多努力的工作後「意外」得到的。但沒有先前的打拼及許多錯誤的
    實驗，只等待是不會有好運上門。所以我把一個人的成就歸結於二
    分藉智慧、二分天註定、六分靠打拼。

      一九九二年的四月廿二日，我在Davis校園榮獲加州大學頒發的「
    教授研究講座」(Faculty  Research Lecture)。這個講座是加州大
    學對校內教授所給予的最高榮譽。我的講題為「不是天才也能在研
    究上受到肯定之道」(How  to	gain  recognition  in  research
    without being a genius)。在講題中，我提出了四個努力的方向供
    大家參考：

      第一、認真及長時間的工作。

      第二、朋友多而敵人少－培養誠實、公正、喜愛助人、及謙虛的
	    個性。

      第三、有好的研究單位、研究同儕、研究生及博士後。

      第四、研究計畫有獨特且深遠、切實的應用範疇。

      我一直覺得工作認真、專心打拼是很重要的。此外，朋友多而敵
    人少也是一個很重要的因素。我一生也發現許多平日幫助別人的人
    ，也會得到許多人的幫助。還有謙虛也是科學家很重要的個性。當
    然好的研究單位及好的研究夥伴也很重要。若是研究的題目是深遠
    且有實用價值，則可以長期受到支持及肯定。我拿博士學位的猶他
    州立大學是個小學校，但我並沒有因此而被排於得獎名列之外，這
    對於從小學校畢業的人是很大的鼓勵。

      乙烯生物合成的研究過程

      我今天想講一些有關乙烯生物合成(biosynthesis)的小故事。乙
    烯是植物賀爾蒙之一，調控許多植物生長、發育及老化的過程。很
    早以前就有人發現香蕉在成熟時，其乙烯的生成量增多達上千倍，
    所以相信香蕉的成熟和乙烯的生成有絕對的關係，但是對於香蕉為
    何會產生乙烯及其化學反應機構，則一直沒有答案。我在植物學上
    的主要貢獻是「闡明乙烯是怎樣在生物體中合成的」。

      乙烯是最簡單的烯屬烴(Olefin)化合物。從事化學構造物簡單的
    乙烯研究有益處也有困難：好處是因乙烯為氣體，而其先驅物不是
    氣體，所以容易分離，在氣相層析儀(GC)內，一分鐘就可以得到結
    果；而壞處是因乙烯是很簡單的化學物，比如在《碳氫化合物百科
    全書》中，就指出生成乙烯的途徑可多達五百多種，因此很難確定
    生成乙烯的途徑。乙烯可能從C_2H_6脫氫而來，也可能由
    CH_3CH_2OH脫水而得．．．等等。但都一一被證實這些化學物不會
    在生物體中合成乙烯，到底什麼化學物是在植物體中作為乙烯的先
    驅物而生成乙烯呢？

      幾千年前埃及人就知道在無花果上滴橄欖油，可以促進其長大與
    成熟，後來知道是因為乙烯生成的關係。在1964年時，Lieberman從
    先前的文獻資料中得知，橄欖油中的重要成分linolenic  acid在抗
    壞血酸(ascorbic acid)及銅和氧的存在下，會有自由基反應產生乙
    烯。由於甲硫胺酸(methionine)是自由基反應有效的清除者
    (scavenger)，加入methionine應會抑制乙烯的生成。但實驗的結果
    ，卻意外發現乙烯生成的速率不減反增。於是他使用相同的反應環
    境，發現methionine產生乙烯的速率比次亞麻油酸(linolenic
    acid)還快，因而發現methionine是乙烯的先驅物。

      當我於1966年到UC	    Davis時，我看到一篇1964年由Abeles及
    Rubinstein發表的論文中提到豌豆的抽出物和FMN反應會生成乙烯，
    但並沒有交待生成的原因，於是我就決定研究到底豌豆成分中，那
    一種化學物導致乙烯的生成？

      首先我將豌豆抽出物分離為上清液(supernatant)及沈澱
    (pellet)兩部份，發現supernatant加FMN可生成乙烯，而pellet部
    份無反應。其次又將supernatant依分子的大小，分成有蛋白質部份
    及無蛋白質的游離小分子部份，發現游離小分子含有反應物。然後
    這些小分子部份又以離子交換樹脂將之分為中性、陰性或是陽性的
    部份。發現陽性部份有反應，這陽性部份就包括一些胺基酸。然後
    以濾紙層析儀(paper chromatography)分析，結果在Rf 0.39到0.52
    間的反應最大。這個部位含有兩種胺基酸纈胺酸(Valine)和
    methionine。 Valine和FMN無反應，但methionine加上FMN就可產生
    多量的乙烯，我們的實驗表示methionine是先驅物。這和Lieberman
    先前的實驗結論相同。

      但用一般化學的方法來想，這是不可能的反應，除非有光。於是
    我又做了一個實驗，證明在有光的環境下，一分子的methionine可
    以轉變成一分子的乙烯，而在黑暗中是不會反應的。這是我到Davis
    教書後發表的第一篇論文。題目就是豌豆抽取物中和FMN反應生成乙
    烯的物質是methionine，而且該反應是需要有光的。後來我又以放
    射活性(radioactivity)的方法，找出methionine上每個碳原子所形
    成的產物。乙烯是由第三、第四個碳所生成的。我非常幸運，第一
    篇論文在到Davis三個月後就發表，而剩下的研究是找出其中間體
    (intermediate)，及了解其反應機構(mechanism)。

      我剛到Davis時，該校的生化系有位有機化學反應機構的專家
    L.L. Ingraham教授，我時常向他請教有關的知識。因為以前學的有
    機反應機構都忘光了，只有到非常迫切需要知道時，才會真正學好
    。特別是要研究代謝中間體，了解反應機構是很重要的。根據一般
    化學反應的知識推測其反應機構，我們認為從methionine到乙烯，
    其反應的中間體分別為KMB(2-keto-4-methylthiobutyric	acid)及
    methional。

      這時候，我以為有關乙烯的生成已經研究完畢。因為已經找到先
    驅物methionine，又知道其中間體與合成的酵素，但後來證明如此
    有機化學和生物合成所經過的途徑是完全不同的，因而所經過的反
    應機構也不同。

      原本深信的反應途徑是

        methionine→KMB→methional→乙烯

      但由於把KMB放入蘋果中，所生成的乙烯比用methionine少，又
    methional不能轉化成乙烯，因而知道上述的生物合成途徑是不對的
    這時已經是1971年了，經過六年時間，先前所做的很多實驗都變成
    沒有用了，因此又得重新再來尋找methionine轉變成乙烯的代謝中
    間產物。後來我們決定改變策略，從研究什麼是乙烯的共同產物，
    進而推測什麼是其代謝中間體。於1977年，我們發現當methionine
    在蘋果裏轉變成乙烯時，methionine分子中的甲硫(methylthio)基
    部份就轉變成甲硫基腺核甘(methylthioadenosine)，因而我們就了
    解在 methionine轉變成乙烯之前，methionine必定先轉變成s-腺核
    甘甲硫胺酸(s-adenosylmethionine(SAM))。到此時，我們對於這個
    生物合成的了解是

      methionine→SAM→"X"化學物→乙烯

      牛頓說：「新的發現，要站在巨人的肩上，則可以看的遠一點。
    」由於植物體內X化學物的含量太低，我們使用一般生化方法偵測不
    出來，於是我們開始尋找相關文獻，希望能從其他的相關訊息找到
    中間產物。在一篇1959年Burg和Thimann發表的論文中，他們發現將
    蘋果以氮氣來隔絕空氣的影響，所產生的乙烯量大大減少，而後一
    旦接觸空氣，則產生非常多的乙烯。也就是說，這個X中間體是和空
    氣中的氧氣反應成乙烯的。利用這個觀念，我們使用隔絕空氣的方
    法來累積放射性X中間體的量，並用濾紙層析儀將X中間體在層析圖
    中的位置測出，這時只要把X中間體化學物檢定出來，就可建立生成
    乙烯的途徑。

      我們分離出來的X中間體化學物，雖具有放射性活性，但幾乎沒有
    質量，因而其化學構造的檢定就必須依賴其放射性的特性。根據放
    射性的化學性質，這個X中間體含有NH_2、COOH、	 CH_2CH_2 。將X
    中間體加氫之後，得到兩個產物Y(30%)和Z(70%)，後來我們檢定出Z
    為2-氨基丁酸  (2-aminobutyric acid)。這時已是1978年夏天，我
    和研究生Adams 發表了一篇學術論文摘要，並提出X中間體可能是乙
    烯基甘胺酸	   (vinylglycine)，因為vinylglycine加氫後轉成為
    2-aminobutyric	     acid。但在學會論文發表前，實驗發現
    vinylglycine並不是X中間體，我和Adams都非常失望。幸好由於祕
    書不小心在摘要裏漏了幾個字，vinylglycine沒有打上去，才免去
    非常尷尬的場面。Adams後來告訴我，當他發現vinylglycine並不是
    X中間體時的那段日子，是他在研究生生涯中最黑暗的時光。.大本
    文    由於已知X中間體加氫會產生2-aminobutyric  acid，於是倒
    回來分析。當2-aminobutyric	   acid脫氫的時候有三種可能產物
    A(vinylglycine)、B、C[一氮四圜		       -2一羧酸
    (azetidine-2-carboxylic acid)]。而其中A和C很快就證明不是X中
    間體。而B產物是一個三角環丙烷化合物，其實我們已經想到很多次
    ，但由於以為在天然界中，如此三角環狀化學物是不可能存在的，
    於是都不以為意。有天晚上我回家時，帶了一本有機化學課本，查
    閱有關環丙烷化合物的加成反應，發現其加氫之後有兩個生成物，
    和我們得到的Y和Z產物的情形很相似。我當時跳了起來，整晚再也
    睡不著了，因為我知道這個B環丙烷化合物，必定是氨基環丙烷羧酸
    (1-aminocyclopropane-1-carboxylic  acid(ACC))，可能就是我們
    尋找很久的X中間體。

      隔天一大早我就到了學校，要Adams去圖書館找些和ACC相關的資
    料。一個小時候後，他回來了，他的雙眼發亮，因為在1957年的一
    篇論文中提到在梨子成熟時會有大量的ACC產生，這和我們所推測的
    結果一致，而且現在已知ACC是天然界存在的物質，下一步就要證明
    ACC	 就是X中間體。.大本文    我在做博士後研究時，學了一個共
    結晶 (co-crystallization)的方法。把某一放射性化學物與其相同
    的物質混在一起，經幾次共結晶後，其相對的放射活性不會減低，
    若是不同的物質，則其相對活性會降低。最後利用共結晶的實驗，
    結果證實ACC就是X中間體。.大本文    在1979年，我們發表了一篇
    論文，闡明以methionine為先驅物產生乙烯的生物合成的途徑如下：

      methionine→SAM→ACC→乙烯.小空
  
      同一年年底，德國著名的大化學公司Bayer經由上千萬種化學物的
    篩選試驗，也發表了相同的結論－當植物以咱HACC處理後，ACC在植
    物體內轉變成為乙烯。乙烯生物合成途徑的研究，終於劃下了完美
    的句點。

      <<後記：楊祥發副院長將於7月16日下午3:00講第3集，談談研究
    乙烯生物合成途徑的其他點滴。>>