◆◇研究計畫簡介◆◇ 酵母菌PRP19蛋白與核糖核酸剪接 分子生物研究所副研究員 鄭淑珍 一九九三年諾貝爾醫學獎頒發給Philip Sharp與Richard Roberts 以獎勵他們八十年代末期發現不連續基因(split genes)對生物學的 貢獻。當時由於與Richard Roberts合作做出此成果的華裔女科學家 周芷博士未獲獎，曾引起廣泛的討論。事過境遷，討論不再，但有 關不連續基因的研究仍然不斷。 何謂不連續基因？原來不同於原核細胞(prokaryotes)，在真核細 胞(eukaryotes)內，絕大多數的基因是呈片段性的，片段之間穿插 了許多不相關的序列。這些多餘的，截斷基因的序列被命名為介入 子(intervening sequences或introns)，而最後存留在細胞質內的 RNA上的序列則命名為表現子(exons)。在基因表現的過程， intron 必須被除去，才能表現出一完整的基因，作出具有功能的蛋白質。 研究的結果顯示，RNA的轉錄(transcription)是線性的， intron與 exon同時被轉錄出來形成前核糖核酸(precursor RNA)，之後intron 才被除掉。這個intron被除掉的過程便稱為核糖核酸剪接 (RNA splicing)。 RNA splicing是基因表現調控的重要一環，它的分子機制極為複 雜，作用因子包括了許多蛋白及五個小核核糖核酸(snRNAs)。這些 因子必須經由一定的順序，組合成一個有功能的剪接體( spliceosome)，剪接反應才能順利進行。剪接體的組合是個多步驟 的過程，由小核核糖核蛋白複合體(snRNPs)與其它蛋白因子在每一 步驟有次序地作用。過去的研究對snRNA的功能有較詳細的了解，它 們經由核酸鹼基配對，在剪接體組合的過程中扮演很重要的角色。 但截至目前為止，大家對蛋白因子所扮演的角色所知甚微。本人博 士後研究時，在John Abelson的實驗室從事剪接體組合機制的研究 多年，對這些蛋白因子的功能一直抱有極高的興趣，回國後便繼續 以酵母菌為系統從事這方面的研究。 我們以研究剪接反應的蛋白因子PRP19為起步，首先經由一株 PRP19的突變種篩選出PRP19的基因，進而培養製造出抗PRP19蛋白的 抗體(anti-PRP19 antibody)。得到了抗體後，遂進行一系列的免疫 沈澱(immunoprecipitation)分析。我們首先要知道的是PRP19與 snRNP和剪接體的關係。實驗結果顯示用抗PRP19抗體可以將剪接體 沈澱下來，表示在剪接反應中，PRP19與剪接體緊密的結合在一起。 然而，PRP19卻不是snRNP的成分因子。顯然地PRP19 P剪接體的結合 不是因為它是snRNP的一部分而隨著snRNP一起作用，可見PRP19有其 獨特的功能。 由於剪接體的組合經由數個步驟，於是我們更進一步的探討究竟 PRP19參與在哪一步。為了研究這個問題，我們先設計了一些方法來 分別截斷剪接體組合的各個步驟，然後利用免疫沈澱法檢驗在各個 被截斷的反應中，PRP19與剪接體組合過程中各個中間體結合的情形 。結果顯示PRP19與剪接體，剪接體發生劇烈的構像轉變，其中 snRNA配對重新組合。但截至目前為止，尚未有任何蛋白因子被發現 參與這個步驟。如此，PRP19蛋白的功能更顯得重要。 為了要研究PRP19蛋白的生化性質，我們必須純化其蛋白。在嘗試 的過程中，我們發現PRP19的作用必須靠另外一些蛋白因子的配合， 且PRP19與這些蛋白結合成一蛋白複合體，因此要了解在剪接體組合 過程中PRP19所扮演的角色，就必須先分離出整個蛋白複合體。然而 要從酵母菌分離出與剪接有關的蛋白複合體是一件艱難的工作，原 因是酵母菌屬進化最低的真核生物，含有intron的基因非常的少， 故執行剪接工作的因子在細胞內含量很低，要在不能大量表現的狀 況下，使用傳統的方法來將其分離出來頗不容易。為此我們設計了 一個親和性層析法，終於分離出了PRP19的複合體。這個蛋白複合體 由至少八個蛋白組合而成，而其中三個和PRP19有直接的作用。很顯 然的這些蛋白代表新的剪接因子，他們在剪接體組合過程中極可能 也扮演很重要的角色。 我們起始於一個蛋白個體PRP19的研究，對它在剪接反應中所扮演 的角色有了些微了解的同時，卻發現它關連著更複雜的機制。在 PRP19蛋白複合體上的這些蛋白因子，是否均是剪接反應的必要因子 ？它們在剪接反應扮演怎樣的角色？在剪接體組合過程中是否與 PRP19參與相同的步驟？這一連串的問題必須等到這些因子的基因被 鑑定出來後才得分曉。是以我們目前最迫切的工作便是採用多種不 同的方法，諸如生化方法或遺傳方法，來鑑定並篩選出這些蛋白的 基因，俾能作更進一步的研究，以對核糖核酸剪接的機制有更進一 步的了解。