長期以來,生物學家渴望藉由發展各種研究策略期待了解生物成長代謝機制,從中找出生命程序的奧妙,以及針對疾病找出因應治療之道。十七世紀安東尼·范·雷文霍克(Antonie van Leeuwenhoek)發明顯微鏡之後,科學家對於生物奧秘的探索便不再是瞎子摸象式在黑暗中摸索,一個鄉民標榜「有圖有真相」的研究視野被開啟,一系列微小的生物細胞、細菌及病毒,甚至於一些過去未知的生命細微個體在顯微鏡下無所遁形,一一揭開其神秘的面紗。然而,科學家並不甘於現狀,希望進一步地了解生命細胞內各種生物分子間的交互作用及其訊息功能傳遞,如何維持細胞的特性與個體性,例如生命的起源來自於細胞內的基因遺傳訊息分子:去氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA),每當細胞分裂時,DNA可以自行複製(replication),因而確保每一代的細胞都帶有同樣基因遺傳特性。當細胞需要表現所需蛋白質時,會將DNA的訊息轉錄到RNA上(transcription),再由RNA轉譯生成蛋白質(translation),而表達出的蛋白質則會執行細胞所需要的功能,這也是分子生物學的中心法則。然而,細胞內的存在著多樣化且具各種不同功能性蛋白質以維持細胞生長的運作,如何了解單一蛋白質在細胞裡面所扮演的角色及其運作上重要性則是科學家所面臨的研究課題。

綠色螢光蛋白(簡稱GFP,Green Fluorescent Protein)的研究,為上述的研究領域點了一盞明燈,同時震撼這個研究領域作出了跨時代的革命性影響,其影響層面之廣,包含細胞分子生物學、藥物開發及其生物感測技術等領域。因為接下來的研究者只需將GFP基因轉殖至所需觀察的蛋白質上即可利用GFP發光團特性,以螢光顯微鏡肉眼觀察特定蛋白質在細胞內的位置、動態及其作用,進而了解如何影響細胞成長運作,如同為蛋白質生物分子簡單戴上智慧穿戴裝置,便可容易清楚了解該蛋白質在細胞內的一舉一動。正當2008年諾貝爾化學獎頒發給下村脩(Osamu Shimomura)、馬丁喬非(Martin Chalfie)與錢永健(Roger Y. Tsien)三位科學家以標榜對GFP重大研究貢獻的同時,科學家也開始思考另一個研究課題,細胞內的重要生物分子不僅止於蛋白質,遺傳傳遞分子DNA與RNA、脂質和蛋白質後修飾的醣類分子同樣表現了影響細胞的運作及其不可忽視的生理活性,如何發展彌補GFP基因轉殖技術僅能螢光標定蛋白質的研究策略,開發針對其他特定生物分子修飾標定的科學方法,以拓展我們對這些生物分子的認知及深層了解。

生物正交性化學(bioorthogonal chemistry)是源自於當時任教於加州大學柏克萊分校化學系教授卡羅琳·貝爾托西(Carolyn R. Bertozzi)在2003年所提出的概念[1],指的是可在活體細胞、生物組織中進行高效能特異的外源性化學反應,並且與細胞代謝過程中複雜生化反應互不干擾,透過此一化學策略,不僅可螢光標定特定生物分子,同時可藉由細微的化學修飾研究生物大分子,以人為手段干擾或調控生命系統,從中闡述複雜生物體系運作的生物代謝機制。有機化學在研究生命科學領域方面相較於其他化學分支學科擁有得天獨厚的優勢,化學家透過合理的設計合成不同功能性的有機小分子作為化學探針,可以有效地探索複雜的生命體系,因此透過化學工具和研究策略認識複雜生命體系的化學生物學領域近年來日益蓬勃發展。卡羅琳·貝爾托西教授認為,細胞分子代謝機制固然複雜,但是依然依循有規律的化學反應組合而成,與一般單純化學鍵生成或斷裂的有機化學反應有所不同之處,在於生命體系中充斥著許多酵素相互協同或拮抗作用的超分子化學組裝和分解反應。為了深入研究和認識這些複雜的生命過程,發展「可視化」研究工具和策略方法,將有助於研究者揭開這些代謝過程的神秘面紗,從而瞭解生物分子的重要性及功能性。

近年來,有機化學家開發了一種名為「點擊化學」(click chemistry)的強大工具,顧名思義,這種化學反應特性在於反應活性極佳,如同一按滑鼠的瞬間,反應便迅速完成,因此「點擊化學」便成為化學生物學家研究生物體系分子的一個核心化學工具,用於化學標記和追蹤複雜生命體系中生物巨大分子或功能性小分子。「點擊化學」首推當時任職史普利克斯研究所(The Scripps Research Institute)貝瑞·夏普利斯(K. Barry Sharpless)教授在2001年發展出一種利用一價銅離子催化疊氮化物(azide)和端炔類(alkyne)作用形成共價鍵,並生成雜環三唑類化合物的化學反應,簡稱CuAAC [Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition][2],此類型化學特性在於,能在常溫條件下的水中進行反應,而且不受反應環境pH值影響反應活性,甚至優化後的反應條件能在活細胞中進行高效能和高控制性反應進行分子標定,衝擊一般人認為有機化學反應必須存在於有機溶劑並需加熱下方可進行反應的認知,當時在化學合成及化學生物學領域引起了極大的注目。以CuAAC為代表的點擊化學概念不只對化學合成領域有很大的貢獻,目前在材料化學、生物製藥和化學生物學的諸多領域上也展現重大廣泛的應用性。

針對「生物正交性化學」的定義,疊氮和炔類這兩種化學官能基皆不常見於複雜生物代謝系統,一般認為屬於「生物性正交官能基」,不會干擾或參與自然生物代謝反應機制,卡羅琳·貝爾托西研究團隊利用化學合成含疊氮官能基的單醣基質(簡稱醣化學探針),並巧妙利用細胞內所存在的醣酵素轉移酶代謝機制的將醣探針引入相關的生物分子,自然形成醣蛋白或醣脂質(策略過程簡稱MOE,metabolic oligosaccharide engineering)[3],通過後續CuAAC反應以相對應的炔類修飾的有機小分子或螢光染料進行化學修飾或可視化螢光標定,藉此獲取蛋白質進行後修飾醣基化作用訊息及其不同生物分子間的交互作用的變化信息,如圖一所示。由於目前研究顯示細胞內生物分子的醣基後修飾化不只可調控細胞功能,同時與癌細胞轉移、心血管疾病以及神經退化性疾病等人類重大疾病息息相關,並且人體中蛋白質半數以上都帶有醣分子,了解這些醣分子修飾及其在細胞生物上扮演角色便日益重要,這種結合生物醣代謝(MOE)及化學反應(click chemistry)的生物分子修飾的策略,使得說明複雜醣化生物大分子與生命細胞體系之相互關係的研究在近年來取得明顯進展成果。在此同時,以一價銅離子催化[Cu(I)-catalyzed]為基礎的CuCCA反應雖然可廣泛用於化學生物學研究,但由於離子細胞毒性,導致在活細胞或生物個體上化學標定的應用上受到極大限制,並不完然符合生物正交性化學的要求。有鑒於此,許多研究團隊設計各種有機配體(ligand)試圖與一價銅離子形成穩定錯合物,目的在減少銅離子使用量,並且可在活體系統的應用上取得重大進展(策略過程簡稱LACuAAC,Ligand-assitsted Cu-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition)[4]。另一方面,卡羅琳·貝爾托西研究團隊則意識到以銅離子催化為基礎的CuAAC反應並無法全然滿足活體系統化學標定的需求,因而提出利用環炔本身高張力性質促使疊氮無須銅離子參與下便可在溫和反應條件中與環炔生成三唑類化合物的化學反應策略,簡稱SPAAC (Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition),目前已有各式各樣八員環炔類衍生物運用於各類型活體系統生物分子標定上[5]。

 

(圖一)利用MOE策略引入醣探針(sugar chemical reporter),搭配生物正交性螢光化學標定法可視化細胞內醣基化生物分子的示意流程圖。 

 

根據生物正交性化學概念的研究思路,目前在細胞中螢光標定醣化分子的方法學一般依循MOE策略,將醣化學探針轉移至細胞代謝機制的醣基化生物分子,緊接著透過生物正交性化學反應將螢光染料標定至醣探針位置,藉此了解醣基化生物分子在細胞內的位置分布及其動態。傳統螢光染料為了有效螢光標定生物分子,通常會置入過量染料以確保充分染色,但染色過程中無法將多餘染料移除所造成的螢光背景雜訊卻是無法避免的問題,針對這個研究課題,筆者研究團隊致力於開發新型適用於生物系統化學反應與智慧螢光染料應用於螢光標定醣共軛生物分子細胞影像研究,藉此有效化學工具,可突破傳統染色方法所面臨的雜訊難題,並且取得清楚的螢光標定醣分子細胞影像,用於後續醣化學生物學方面研究。正交性螢光智慧染料的設計概念為,將未反應螢光染料視為未連接上電源插座的燈泡,分子並不具有螢光放射特性,一旦經由化學反應與醣探針結合,所產生的化學鍵結可以想像成燈泡已與插座連結,智慧染料便會具有螢光性質如同啟動燈泡發光,清楚顯示細胞內醣探針位置,未反應的染料則因無螢光性質,並不會干擾細胞螢光影像,所以免除繁雜清洗的染色步驟,同時提供即時的螢光細胞影像分析研究。目前研究團隊針對CuAAC 及SPAAC化學反應個別設計AzBOCEt與coumOCT相關螢光智慧染料[6,7],如圖二所示。這些研究的成果期許能在目前熱門醣化學生物學領域及生物正交性化學應用作出個人的研究貢獻。

 

(圖二)兩種螢光智慧染料(AzBOCEt和coumOCT)化學標定細胞內醣基化生物分子,染色過程中無需繁雜移除染料步驟下,所呈現即時螢光細胞影像。

生物正交性化學的發展方興未艾,這種透過化學修飾了解生物系統的概念萌芽至今未滿二十年,但該研究思維促使許多的「化學反應」被開發,並視為生物正交性化學應用到生命科學的研究中。許多化學家也透過生物正交性概念,發展各種小分子探針及其研究策略闡明複雜生物大分子的功能及作用。在過去十數年中,生物正交性化學已成為化學生物學的重要工具,幫助科學家更好地理解與研究不同的生物代謝作用過程,各類型生物正交性化學反應被廣泛應用於蛋白質修飾、高通量測序、細胞或亞細胞分子結構選擇性標記、蛋白質譜學等研究領域。十月正值諾貝爾獎頒布之際,可以預期地「生物正交性化學」這個研究領域將是未來諾貝爾化學獎熱門候選名單之一。

 

參考文獻:
[1]. Sletten, Ellen M.; Bertozzi, C. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974–6998. “Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality”
[2]. Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596−2599. “A stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes.”
[3]. Laughlin, S. T.; Bertozzi, C. R. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930−2944. “Metabolic labeling of glycans with azido sugars and subsequent glycan-profiling and visualization via Staudinger ligation.”
[4]. del Amo, D. S.; Wang, W.; Jiang, H.; Besanceney, C.; Yan, A. C.; Levy, M.; Liu, Y.; Marlow, F. L.; Wu, P. J. Am. Soc. Chem. 2010, 132, 16893–16899. “Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo Imaging of glycans.”
[5]. Jewett, J. C.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1272−1279. “Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.”
[6]. Shie, J.-J.; Liu, Y.-C.; Lee, Y.-M.; Lim, C.; Fang, J.-M.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 9953‒9961. “An azido-BODIPY probe for glycosylation: Initiation of strong fluorescence upon triazole formation.”
[7]. Shie, J.-J.; Liu, Y.-C.; Hsiao, J.-C.; Fang, J.-M.; Wong, C.-H. Chem. Commun. 2017, 53, 1490‒1493. “A cell-permeable and triazole-forming fluorescence probe for glycoconjugate imaging in live cells.”