一、前言

相較於傳統的X光攝影,只能區別對於X光而言,穿透性難易(也就是X光吸收係數或是厚度不同)所造成的差別。新穎的X光攝影術,則可以運用光線偏折的影響,來區分更微小的差異。正如同對可見光同樣是透明的水跟空氣,卻可以從其折射率不同而觀察到空氣和水的介面位置。也因為此新的對比機制,X光在被發現了一百年後,終於具有足夠的解析度及對比,正式成為目前具有最高解析度的非破壞檢測顯微技術。由我國、韓國及瑞士研究人員所組成的ICPCIR(International Consortium of Phase Contrast Imaging and Radiology)研究團隊在過去數年間將此成像原理利用到物理、化學、材料及生命科學等領域的現象。其中主要的理論背景及實際應用,已經陳述於最近的文獻中[1]。我們目前被委任管理位於新竹同步輻射中心的BL01A SWLS光束線以及韓國浦項光源的7B2-X光顯微術光束線,在不刻意追求單色光的情況下,可以在時間跟空間解析度上獲得最大的可能性。以下,我們將介紹最近的主要成果。

二、技術背景

相對比X光顯微術利用物體中不同組織對於X光的折射率微小差異,讓X光在通過時產生偏折,因而在組織界面上形成鮮明的對比,而非傳統靠X光的吸收來成像。影像對比形成的條件需要準直的光源以及X光波長的同調性。在實際操作上,不論是所謂的第三代同步輻射研究中心、浦項同步輻射光源及或是較簡易的新加坡同步輻射光源所產生的X光,都能符合以上需求。

在不犧牲相對比顯微術的影像品質為前提下,為了將同步輻射X光的優點毫不浪費地全部發揮,我們在設計ICPCIR光束線時,做了特別的決定,亦即取消單色分光器(monochromator)的部分。如此我們可輕易的得到比單色光光束線要強上千倍之多的X光,並能在高解析度(< 1 µm)的操作條件下達到短至一毫秒(millisecond)的曝光時間,以達成即時、臨場實驗的要求。

也因如此的特性才得以滿足某些實驗的特殊需求,諸如以非破壞方式檢視稀有珍貴的古生物化石樣品、即時觀察電鍍過程[2-3]、無顯影劑的微血管造影術[4]、在三度空間中解析細胞結構[5]、研究混泥土在乾燥水合過程中的微觀化學反應以及檢視電子產業常用的幾項製程技術等等。還有許多其他的例子需借助高的影像擷取速度,以進行動態觀察。

目前本設施的整體性能,如小於1微米的空間解析度、小於1毫秒的時間解析度,已使它成為相當具競爭力的顯微工具。而X光獨特的穿透力,使我們得以觀察高於解析度104次方倍的厚樣品(如以1微米的解析度來觀察細胞,在厚達1公分的組織切片中仍可利用電腦斷層掃描方式重組出細胞結構)。其在影像上的卓越區分性及靈敏度(>1012 in volume)正可以補足其他電子顯微鏡或是光學顯微技術的不足。目前正在進行中的設備升級更能將解析度近一步提高至20-30奈米(nm)層級,當研究三維的微觀組織時,高解析度相對比顯微術將成為是最佳選擇。

三、材料科學方面的結果

圖一A顯示一個X光顯微鏡所能進行動態即時分析的最佳實例。左圖的影像為在銅底材上電鍍鋅。在電鍍的過程中,發現氫氣泡於銅底材表面發展並迅速消失的現象。此連拍影像顯示一個難以置信且會嚴重影響鍍層結構的機制:許多鋅鍍層並非鍍在銅底材上,而是在陰極表面逐漸成長的氫氣泡上。鋅鍍層逐漸的包覆氫氣泡,最後於鍍層中形成許多氣孔,嚴重影響鍍層的附著性和機械性質。

      圖一B顯示另一個實例的X光顯微照片。圖a-d是由連續快拍的電影影像所擷取,顯示利用局部電化學層積(Localized ElectroChemical Deposition,LECD)方法於銅底材上成長似鬍鬚狀的銅結構。當中大倍率的影像為最後的產物。

藉由即時監控局部電化學層積的過程,我們能進一步的發展較先進且優良的局部電化學成長模式。標準的局部電化學層積過程,於電鍍液中一旦微結構接觸到不溶陽極,會使不溶陽極自動與微結構保持距離並繼續成長,此現象會導致形成多孔的微結構。利用我們提出的非接觸模式,不溶陽極與微結構間保持有限且固定的距離。藉由這個模式所產生的微結構較為緻密。

利用相對比X光顯微術即時觀察此類局部電化學層積過程的優勢非常明確,即為高景深、高穿透率允許我們來監控相當複雜的電化學反應以及足夠的時間解析度來觀察微結構的變化。此外也可避免利用光學顯微鏡上觀察時,大量氫氣泡形成所產生的干擾。我們並觀察到電鍍過程中,金屬離子濃度在陰極表面的變化。這些能力足夠讓我們以獨特的技術層面來研究電化學複雜的反應。

四、生命科學方面結果

我們的技術可爲生命科學領域提供多好的解析度?根據我們以植物、動物細胞實驗顯示,細胞以及次細胞層級的生物結構應該是可以輕易觀察到的。例如我們以大鼠大腦神經細胞經固定後所呈現的型態,除了神經元本體之外,其軸突也清晰可見。這些細胞的樣品只是使用標準生物樣品製備方式,並未針對X光顯微影像做特殊處理。此外,包埋在膠原蛋白內的神經細胞樣本厚度約為300微米,較一般光學顯微鏡的樣本厚。

我們技術中的另一項成果則是證明相對比的增益效果可在不使用造影劑的情況下觀測到微小的血管,有可能使用在醫學診斷上。此研究結果曾經自然雜誌報導,讀者可自行參閱[6]。

五、顯微斷層重建影像

搭配斷層照相術重建,X光顯微術將可大幅改善外觀型態分析的能力。圖二A為兩張利用斷層照相術重建果蠅頭部,由1000張不同角度拍攝影像的結果。眼部結構與眼睛附近的細毛以及在腦部內部扁長的結構特徵清晰可見。

      藉由微斷層照相術,我們甚至可達到與超越2D影像品質的細胞的三度空間重建影像。圖二B中所示是剝除葉片底部表皮後所取得葉子的細胞樣品。B 1的個別影像清晰地展現氣孔細胞打開的情形,而B2則是葉子氣孔部份細胞的3D重建影像。

圖二C為利用斷層照相術重建的老鼠主動脈橫截面。血管壁的內部結構清晰可見。主動脈壁為一波浪狀的彈性薄層結構,其最內部(黑色箭頭所示)與管腔被單層內皮細胞(白色箭頭所示)所隔離。C2為此試片所對應的3D結構。白色箭頭所指的為相鄰細胞間的邊界,而黑色箭頭所指的是從表面擠出的細胞核,且其外觀輪廓完全地保留且呈現在3D重建分析中。藉由這個例子,我們突破了僅拍攝細胞個別影像的技術水準,提供了大型組織內細胞結構的資訊。

六、結語

從這些研究成果我們可以很清楚地知道,以折射係數為基準的同步輻射X光顯微術已快速發展為一成熟的技術,可以在各種不同的系統上做次微米等級的臨場檢測研究。本項技術發展尚未達到極限,其最終極的潛力仍深不可測。我們目前正致力於繼續提高影像的解析度及更廣泛的應用。未來將有更多有趣的挑戰在等待我們。

References
1.Y. Hwu, et al., J.H. Je, J. Phys. D, 35, R105-120 (2002).
2.W. L. Tsai, et al., Nature 417, 139 (2002).
3.S. K. Seol, et al., Electrochemical and Solid-State Letters, 7(9) C95-C97 (2004).
4.Y. Hwu, et al., Biophysical Journal 87, 4180-4187(2004) [Biophotonics Research, Biophotonics International, Dec. 2004.]
5.Y. Hwu, et al., Phys. Med. Biol. 49 501-508 (2004)
6.“What a Contrast!” Medical Technology in News and Views, Nature, 427, 800(2004).