植物與人一樣,會被各式各樣的病原感染而生病。其中,農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)可說是最為聲名遠播的植物病原菌之一。這種細菌普遍生活在土壤中,在遇到適合的植物宿主時會入侵植物,造成植物細胞增生形成腫瘤,稱為癌腫病(crown gall disease)。這個植物的腫瘤宛若農桿菌的豪宅,不只提供住宿還附贈它愛吃的養分,讓農桿菌在這裡增生繁殖。究竟農桿菌是如何成為成功的植物病原菌,在激烈的競爭環境中脫穎而出、征服宿主乖乖聽話?而科學家們又如何化危機為轉機,將這隻細菌變成強而有力的遺傳工程師呢?

看不見的細菌大混戰──農桿菌的競爭篩選機制

覬覦肥美多汁的植物的可不只有農桿菌這種細菌,事實上,自然界中充斥著各式各樣的微生物。這些微生物有時合作有時競爭,無論是土壤、水域還是生物體內,在我們看不到的微觀世界中時時刻刻都上演著廝殺戲碼,農桿菌當然也無法置身事外。

江湖在走,武器要有。細菌們為了求生存,演化出各式各樣的武器來應付不同的競爭對手,第六型分泌系統(Type VI secretion system, T6SS)便是其中一種用於細菌間內鬥的武器。在電子顯微鏡下可以看出T6SS是由許多蛋白質組裝而成像是針筒一樣的構造,用來刺入其他細菌之中,將效應分子(effector)送入以殺死或抑制競爭者的生長,以增進自己的生長或競爭優勢。

打仗內鬥可是件傷神耗時的事情,農桿菌的資源有限,該如何決定什麼時候該端槍打仗、什麼時候又應該放下武器養精蓄銳呢?透過在農桿菌C58菌株T6SS的深入研究,我們發現C58菌株會製造一個叫作Tde的效應分子,Tde是具有分解DNA能力的殺菌毒素,會由座落在T6SS針筒尖端的蛋白質VgrG所攜帶,再注射入敵菌之中[1][2]。而Tde和VgrG這兩個蛋白質的結合就像是開火訊號一般,會啟動細菌快速組裝T6SS並將這些殺菌毒素送入目標細菌之中[3]。

有了攻擊訊號,還要擔心子彈不長眼,在一團混戰之中要是誤傷友軍可就得不償失了。那麼,農桿菌是否能夠辨識敵我,讓自己的武器不要傷害到隊友呢?本研究團隊利用不同來源的農桿菌菌株在植物體中兩兩競爭,並且分析它們之間的親緣關係,發現農桿菌傾向對自己的「熟人」網開一面──它們對於親緣關係相近的菌株的殺傷力較弱[4],但對親緣關係較遠的農桿菌菌株或非農桿菌的細菌如大腸桿菌(Escherichia coli)就展現較強的殺傷力。有趣的是,不同的大腸桿菌菌株面對農桿菌的T6SS攻擊也會展現不同的傷亡程度。藉由讓農桿菌攻擊不同的大腸桿菌突變株的實驗,本研究團隊發現有幾株大腸桿菌突變株可抵抗農桿菌T6SS的殺傷力──也就是說擁有這些基因產物的的大腸桿菌會更容易被農桿菌的T6SS攻擊殺死。這表示這些大腸桿菌的基因產物可能被農桿菌用來增進T6SS的攻擊能力或殺菌毒素的殺傷力[5]。可見農桿菌在這場大混戰中眼睛可亮著呢!不只可以區別同類或異己,也能夠借刀殺人,搶奪敵軍的資源來成就自身的勝利。

你的超能力就是我的超能力──農桿菌轉基因機制及其應用

當農桿菌終於從競爭激烈的細菌內鬥中存活並循著植物所釋出的物質找到夢寐以求的宿主時,它會掏出另外一把槍──第四型分泌系統(Type IV secretion system, T4SS),這個武器可以用來「洗腦」它的宿主,讓宿主們心甘情願地供吃供住。

農桿菌能夠如此騙吃騙喝的祕密就在一個獨立於染色體之外的腫瘤誘發質體(Tumor-inducing plasmid, Ti plasmid),在植物宿主分子訊息的刺激之下,這個腫瘤誘發質體上的一群基因可以做出組成T4SS的零件及其他能協助致病的蛋白質,還會將自己的其中一個片段透過T4SS送進宿主的細胞裡面。科學家們將這個會被轉移的DNA片段定義為轉移DNA (transferred DNA, T-DNA)。轉移DNA在進入植物細胞之後會嵌入植物細胞核的染色體中,因為這段DNA序列中包含了製造植物荷爾蒙以及細菌專屬養分的基因,所以會誘導植物細胞不斷分裂增生變成腫瘤,也製造了農桿菌喜歡的養分[6]。

魔高一尺,道高一丈。科學家對農桿菌的腫瘤誘發質體動了些手腳,將農桿菌原本要送入植物的轉移DNA基因移花接木,換成自己想送入植物的基因序列,便可以利用農桿菌的特性製作出會表現特定基因產物的植物。除了用於製作轉基因作物外,在科學研究上也可以用來研究植物基因的功能。例如,利用農桿菌會將轉移DNA隨機插入植物基因組的特性,農桿菌可以用來製作具有不同基因被破壞的植物突變株,也能夠反過來利用轉移DNA攜帶特定核酸序列,以病毒誘導之基因靜默(virus-induced gene silencing)原理讓特定的植物基因表現下降。這些工具讓科學家得以觀察植物具有或者缺乏某些基因的時候表現的性狀,對於科研發展功不可沒。

多年來,許多科學家致力於改良與研發農桿菌基因轉殖的方式,除了希望能夠更穩定有效率地製作轉基因植物外,也開發能夠縮短實驗時間、增加樣本數量的研究工具。其中,本研究團隊所開發的AGROBEST方法可以同時感染大量植物幼苗快速進行農桿菌基因轉殖。透過這個高通量感染實驗,科學家們能夠更有效率地得到農桿菌轉殖的基因表現結果,加速研究進程[7]。

就像是人體免疫反應懂得對抗外來病菌,植物面對農桿菌自然也不會乖乖就範,這使得利用農桿菌進行基因轉殖的方式遇到瓶頸。要如何騙過植物、增加農桿菌基因轉植成功率一直是個待解的難題。本研究團隊發現,當AGROBEST實驗中以緩衝液維持酸鹼值在pH 5.5的時候可以達到最佳的轉基因效率,其中原理是因為穩定的pH值會抑制植物細胞攝取鈣離子,進而抑制植物的免疫反應[8]。

雙面農桿菌──從植物腫瘤病原菌化身為遺傳工程師

19世紀初期證明農桿菌為造成癌腫病的元兇時,誰也沒想到這些令人頭疼的細菌如今會搖身一變成為植物科學研究及農業科技不可或缺的工具,這也證明探索奧妙生命現象及基礎研究的重要性。透過對其獨特的跨界遺傳物質轉移的分子機制研究,以及不斷改良使用方式及擴展其應用,我們期許這個工具在未來能夠更加成熟與方便,為科學研究及社會帶來更多福祉。

圖一、農桿菌生存競爭及感染植物宿主的策略
農桿菌身懷不同的武器,在面對不同的環境和接觸對象則會啟動不同的因應策略。當面對敵軍時會聯合盟軍一起啟動第六型分泌系統(T6SS)殺菌武器來捍衛自己族群的生存空間,遇到合適的植物宿主時則趕快製造致病蛋白質,合力運送轉移DNA,經由第四型分泌系統(T4SS)通道運送到植物細胞內,誘導植物產生腫瘤供其居住繁殖。

深入閱讀

1.Ma LS, Hachani A, Lin JS, Filloux A*, and Lai EM* (2014) Agrobacterium tumefaciens deploys a superfamily of type VI secretion DNase effectors as weapons for interbacterial competition in planta. Cell Host & Microbe. 16(1):94-104. doi: 10.1016/j.chom.2014.06.002. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/140.
2.Bondage D, Lin JS, Ma LS, Kuo CH, and Lai EM* (2016) VgrG C-terminus confers the type VI effector transport specificity and is required for binding with PAAR and adaptor-effector complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jul 5:113(27):E3931-40. doi: 10.1073/pnas.1600428113. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/65.
3.Wu CF#, Lien YW#, Bondage D, Lin JS, Pilhofer M, Shih YL, Chang JH, Lai EM*. (2020) Effector loading onto the VgrG carrier activates type VI secretion system assembly. EMBO Rep. 2020 Jan 7;21(1):e47961. doi: 10.15252/embr.201947961. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/374.
4.Wu CF, Santos MNM, Cho ST, Chang HH, Tsai YM, Smith DA, Kuo CH*, Chang JH*, Lai EM* (2019) Plant pathogenic Agrobacterium tumefaciens strains have diverse type VI effector-immunity pairs and vary in in planta competitiveness. Mol Plant-Microbe Interact. Mar 4. doi: 10.1094/MPMI-01-19-0021-R. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/362.
5.Lin HH, Yu M, Sriramoju MK, Hsu ST, Liu CT*, and Lai EM* (2020) A high-throughput interbacterial competition screen identifies ClpAP in enhancing recipient susceptibility to type VI secretion system-mediated attack by Agrobacterium tumefaciens. Front. Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2019.03077. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/378.
6.Hwang HH*, Yu M, and Lai EM*. (2017) Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book 15: e0186. USA: American Society of Plant Biologists.: e0186. doi: 10.1199/tab.0186.
7.Wu HY, Liu KH, Wang YC, Wu JF, Chiu WL, Chen CY, Wu SH, Sheen J, and Lai EM.* (2014) AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analysis in Arabidopsis seedlings. Plant Methods. Jun 18;10:19. doi: 10.1186/1746-4811-10-19. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/143.
8.Wang YC#, Yu M#, Shih PY, Wu HY, Lai EM* (2018) Stable pH suppresses defense signaling and is the key to enhance Agrobacterium-mediated transient expression in Arabidopsis seedlings. Sci Rep 8(1):17071. doi: 10.1038/s41598-018-34949-9. https://ipmb.sinica.edu.tw/ch/activities/highlights/340.