世界衛生組織(WHO)於2020年3月11日宣布2019年末在中國武漢發現的新冠病毒(SARS-CoV-2) 引起的新冠肺炎(COVID-19)已進入全球大流行。在新型傳染病防治環節中極為重要且急迫的是感染者的普遍及快速檢測。

當今分子檢測的技術可分為三大類型:第一種是檢測病毒基因是否存在RT-PCR(反轉錄聚合酶連鎖反應)方法,一旦病毒基因可以被放大檢測出來,就可以確定被病毒感染;但是這種方法對於技術、設備、及實驗室操作的要求很高,同時此方法耗費很高,檢測時間較長,因此難以大量廣泛運用。

第二種檢測方法是量產病毒的抗原(antigen),可以很快的應用抗體檢測側流免疫層析(LFIA)裝置(抗體檢測LFIA裝置)(圖一(A))或酵素結合免疫吸附分析(ELISA)(圖二) 等方法,檢測人體血液中,被病毒感染後經由免疫刺激所產生的抗體(antibody),但是此類檢測方法無法提供患者在感染急性期的傳染資訊,只能應用於感染後的感染盛行率調查,以及檢測經病毒感染後,病患抗體的產生比率及抗體存在血清中的時間,藉以當作疫苗研發與政府公共衛生政策研擬施行的參考。

第三種方法是應用抗體檢測病毒抗原的存在,可以類似流感快篩的方式應用抗原檢測LFIA裝置(圖三(A)),在感染急性期檢測是否被病毒感染,然後可以及時對感染病患進行隔離及治療,藉以防治疾病傳播。這種抗原檢測LFIA裝置既快速(約15-20分鐘)且無須特殊的技術、設備、及專業的操作人員,在資源不足的時期或地區尤其具有價值。抗原檢測LFIA裝置的關鍵是能夠專一結合病毒抗原的一對抗體,這兩個抗體可以分別辨識抗原分子上的兩個不同區域(epitope,抗原決定位),在抗原檢測LFIA裝置上分別用來捕獲及檢測病毒抗原的存在。然而要找到這樣的一對抗體通常費時耗力,因此抗原檢測LFIA裝置是前述三種檢測方式中,研發速度最為緩慢的一種。

圖一:抗體檢測LFIA裝置及其結果判定。圖示測試線上的抗原為結構編號2CJR新冠病毒核蛋白抗原的兩個C端區塊。(A) 抗體檢測LFIA裝置示意圖。抗體-金結合墊中含有已被奈米金粒子標識且可辨識IgG的抗體,控制組線為可辨識抗體-金的抗體或蛋白。(B) 抗體檢測LFIA裝置實際檢測結果。

圖二:抗體檢測酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)。圖示抗原為結構編號2CJR新冠病毒核蛋白抗原的兩個C端區塊。

圖三:抗原檢測LFIA裝置及其結果判定。圖示抗原為結構編號2CJR新冠病毒核蛋白抗原的兩個C端區塊。(A) 抗體檢測LFIA裝置示意圖。抗體-金結合墊中的抗體是已被奈米金粒子標識,並且與測試線中的抗體可成對並同時辨識病毒抗原。控制組線中的抗體通常是可辨識IgG的抗體或蛋白。(B) 抗體檢測LFIA裝置實際檢測結果。

 

我們對COVID-19抗原檢測挑戰的解決方法:

我們實驗室過去十餘年系列研究發展所建立的「噬菌體表達合成抗體庫的技術平台」的應用之一就是可以針對抗原快速開發適用的抗體,藉以迅速解決前述抗原檢測LFIA裝置研發的技術瓶頸,此技術平台已獲得多項國內外專利。我們運用此技術平台,在僅僅19天內領先全球,針對新冠病毒、嚴重急性呼吸道症候群(SARS) 冠狀病毒及中東呼吸症候群(MERS) 冠狀病毒等的核蛋白,找到193株可應用於抗原檢測LFIA裝置研發的單株抗體(圖一(B)),並已提交國內外專利申請。

研究分析發現,這些抗體具備抗原高度特異性,不會辨識導致人類普通感冒的四種冠狀病毒的核蛋白。這樣的抗原檢測LFIA裝置可應用於定點照護檢驗(Point of Care Testing),不僅易於使用、可加快臨床決策、並可減輕中央實驗室的負擔。因應本次新冠肺炎的世界大流行,這個快速發展抗原檢測LFIA裝置的技術平台充分顯示了其優勢,比起傳統方法先使實驗動物對傳染病抗原產生免疫反應,再篩選其中有高結合度的單株抗體,我們的技術平台相對成本極低,並可節省至少2個月的時間。在找到新冠病毒N蛋白的抗體之後,我們實驗室在一個月內完成了抗原檢測LFIA裝置的原型製作(圖三(B)),於2020年4月10日開始交付廠商技術及生物材料進行量產準備,迄今已有超過10家國內及國際廠商進入技術轉移流程(https://iptt.sinica.edu.tw/posts/139911)。

同樣的技術也可應用於其它人類或動物傳染病爆發流行時使用。本實驗室曾應用此技術平台在2016年開發出禽流感抗原檢測側流免疫層析裝置,並在2019年開發出非洲豬瘟抗原檢測LFIA裝置。至今已經多次確定新型傳染病爆發流行時,經由本噬菌體表達合成抗體庫技術平台來尋找具有抗原特異性的單株抗體,將可無須使用動物實驗設施,大大減低了時間、耗材、及實驗設施上的需求。

實踐願景致力創新-抗體開發不再依賴於動物免疫系統:

此一技術平台經過長時間系列研發而成(1-21),這些工作的願景即是抗體開發不再依賴於動物免疫系統(2,3,7)。動物免疫系統產生抗體的過程如同是一個 「黑盒子」難以掌控,因而限制了人類開發抗體的能力及其廣泛運用。

自2004年在中央研究院建立實驗室以來,基於對抗體結構、功能及抗體-抗原相互作用的生物、物理及化學屬性的深度了解,同仁們運用人工智慧計算工具,以抗體-抗原相互作用的數據資料為基礎,設計合成抗體庫群組。所設計的合成抗體庫及抗體設計的原理再經由抗體開發過程來驗證:我們建立了一個噬菌體表達合成抗體庫的核心技術平台,以DNA化學合成建立所設計的抗體基因庫,以大腸桿菌及噬菌體展示系統表達抗體基因庫,並儲存合成抗體庫群組。一旦取得抗原,針對抗原的新穎抗體便可利用已儲存之噬菌體表達合成抗體庫群組進行篩選。這項核心技術不但彌補了傳統動物實驗技術為基礎的抗體開發系統的不足,而且是一項創新的技術平台,以低花費、高通量來開發傳統動物技術不易找到的新穎抗體,可用於各種生物檢測及治療用途。

新抗體工程技術的未來展望:

我們的抗體工程技術平台的成功建立可以提昇生物科技及醫療藥物產業的優勢競爭力。我們在新冠病毒抗原快速檢測上得到的成就來自於多年來對於發展抗體技術的願景,即以全新模式開發抗體來取代傳統的動物實驗方法。

近年來,因基因體解析、計算資訊、人工智慧、及生物合成技術的發展產生了巨量的蛋白質及抗體序列數據,使得我們對天然及合成抗體的結構與功能有更深入的認識,這些技術與知識的整合掌握可以讓我們繼續發展治療及診斷的新穎抗體,並持續瞭解人體對各種病原的自然抗體反應。在此次新冠肺炎大流行帶給全世界的危機與迫切需求中,我們的抗體工程技術平台對於因應檢測挑戰已做出一些貢獻。展望未來的抗體開發與創新,也將為治療疾病提供有異於動物抗體的新創抗體藥物或檢測試劑,提供預防及治療疾病前所未有的方向。

 

參考文獻

1 Kuo, W. Y. et al. Antibody-drug conjugates with HER2-targeting antibodies from synthetic antibody libraries are highly potent against HER2-positive human gastric tumor in xenograft models. MAbs 11, 153-165,(2019).
2 Jian, J. W. et al. Effective binding to protein antigens by antibodies from antibody libraries designed with enhanced protein recognition propensities. MAbs 11, 373-387,(2019).
3 Chen, I.-C. et al. High throughput discovery of influenza virus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries. Scientific reports 7, 14455,(2017).
4 Jian, J. W. et al. Predicting Ligand Binding Sites on Protein Surfaces by 3-Dimensional Probability Density Distributions of Interacting Atoms. PLoS One 11, e0160315,(2016).
5 Hou, S. C. et al. High throughput cytotoxicity screening of anti-HER2 immunotoxins conjugated with antibody fragments from phage-displayed synthetic antibody libraries. Scientific reports 6, 31878,(2016).
6 Tung, C. P. et al. Discovering neutralizing antibodies targeting the stem epitope of H1N1 influenza hemagglutinin with synthetic phage-displayed antibody libraries. Scientific reports 5, 15053,(2015).
7 Chen, H. S. et al. Predominant structural configuration of natural antibody repertoires enables potent antibody responses against protein antigens. Scientific reports 5, 12411,(2015).
8 Peng, H. P., Lee, K. H., Jian, J. W. & Yang, A. S. Origins of specificity and affinity in antibody-protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 111, E2656-2665,(2014).
9 Hsu, H. J. et al. Antibody variable domain interface and framework sequence requirements for stability and function by high-throughput experiments. Structure 22, 22-34,(2014).
10 Chang, H. J. et al. Loop-sequence features and stability determinants in antibody variable domains by high-throughput experiments. Structure 22, 9-21,(2014).
11 Yu, C. M. et al. Rationalization and design of the complementarity determining region sequences in an antibody-antigen recognition interface. PLoS One 7, e33340,(2012).
12 Tsai, K. C. et al. Prediction of carbohydrate binding sites on protein surfaces with 3-dimensional probability density distributions of interacting atoms. PLoS One 7, e40846,(2012).
13 Chen, C. T. et al. Protein-protein interaction site predictions with three-dimensional probability distributions of interacting atoms on protein surfaces. PLoS One 7, e37706,(2012).
14 Lee, Y. C. et al. Effects of signal sequence on phage-displayed disulfide-stabilized single chain antibody variable fragment(sc-dsFv) libraries. Biochem Biophys Res Commun 411, 348-353,(2011).
15 Huang, Y. J. et al. Engineering anti-vascular endothelial growth factor single chain disulfide-stabilized antibody variable fragments(sc-dsFv) with phage-displayed sc-dsFv libraries. J Biol Chem 285, 7880-7891,(2010).
16 Chen, I. C. et al. Signal sequence as a determinant in expressing disulfide-stabilized single chain antibody variable fragments(sc-dsFv) against human VEGF. Mol Biosyst 6, 1307-1315(2010).
17 Chang, H. J. et al. Molecular evolution of cystine-stabilized miniproteins as stable proteinaceous binders. Structure 17, 620-631(2009).
18 Hsu, H. J. et al. Factor Xa active site substrate specificity with substrate phage display and computational molecular modeling. J Biol Chem 283, 12343-12353(2008).
19 Chen, C. T. et al. Protease substrate site predictors derived from machine learning on multilevel substrate phage display data. Bioinformatics 24, 2691-2697(2008).
20 Peng, H. P. & Yang, A. S. Modeling protein loops with knowledge-based prediction of sequence-structure alignment. Bioinformatics 23, 2836-2842(2007).
21 Hsu, H. J. et al. Assessing computational amino acid beta-turn propensities with a phage-displayed combinatorial library and directed evolution. Structure 14, 1499-1510(2006).