植物的「硝酸鹽轉運蛋白」為什麼重要?

過去僅知道植物會利用氮肥中的硝酸鹽做為養分來源,而利用分子生物學的技術,可探討植物吸收硝酸鹽的機制,及如何有效利用硝酸鹽等未解之謎。藉由了解轉運蛋白的作用機制,進而提升植物利用氮肥的效率,從最微小的基因尺度,用科學方法來改善農業、環境以及能源等問題。

長年投身於研究植物硝酸鹽轉運蛋白,中研院分子生物研究所特聘研究員蔡宜芳的研究成果,不僅刊登於國際頂尖期刊Cell 中,更於日前獲頒臺灣傑出女科學家獎。  攝影│張語辰

從大學時開始進入實驗室做實驗,到現在擁有自己的研究團隊,蔡宜芳也帶領著下一個世代繼續研究。她向我們分享這一路走來的點點滴滴,望著窗外一片青綠,蔡宜芳談起為什麼願意投身植物的研究,她笑說:「因為覺得植物很美,植物默默在那邊生長,無怨無悔地提供我們人類養分。」

植物是如何吸收硝酸鹽作為養分,及其中轉運蛋白如何運作?

植物可以吸收的兩種氮源型態為:硝酸鹽、氨鹽。不管是施用什麼形式的氮肥,土壤中的細菌都會幫忙轉換成植物可以吸收的型態。而在土壤中,由於硝酸鹽的含量比較高,所以植物主要是吸收硝酸鹽進入體內作為氮源。

我們在三十年前就知道氮肥很重要,並且多是以硝酸鹽形態被植物吸收,但相關的研究主要集中在傳統生理探討,並不知道在這個機制裡,植物體內負責吸收硝酸鹽的蛋白是什麼。

細胞膜是通往細胞內外的必經路障。而硝酸鹽是帶電離子,無法自己通過由脂質構成的細胞膜,必須由蛋白質的協助才能通過。

1990-1993 年,我在美國做博士後的時候,植物的分子生物技術才剛發展起來。在那之前的實驗多是測植物吸收硝酸鹽的能力;或是在不同環境下,吸收能力變化等較傳統的生理實驗。然而,我們以前都不知道,是什麼樣的蛋白質在負責硝酸鹽的通輸。

因為這個蛋白質很難找,差不多有兩年的時間,我經常整天都坐在電生理實驗檯上。在當時的技術背景下,需要建立新的研究方法。當時的實驗室老闆也曾經一度想停掉這個計畫案,擔心我白白花費太多時間在這上頭,但我想的是既然都作到一半了,就繼續堅持下去。

1994 年回臺灣之後,我們團隊陸續發現,位於植物細胞膜上的硝酸鹽轉運蛋白 CHL1 身兼數職。

CHL1 蛋白不僅轉運硝酸鹽進入細胞內進行運用,更會感測土壤環境中的硝酸鹽濃度後,調控下游基因表現來幫助植物更有效率地利用硝酸鹽。透過研究此轉運蛋白,我們可更進一步了解農作物利用氮肥的原理與機制。

位於細胞膜,身兼數職的硝酸鹽轉運蛋白 CHL1 。
資料來源│C.-H. Ho, S.-H. Lin, H.-C. Hu, and Y.-F. Tsay* (2009) CHL1 Functions as a Nitrate Sensor in Plants. Cell 138, 1184–1194. 圖說重製│江佩津、張語辰

 

從早期的植物研究方法,到現今的分子生物研究技術,如何在這類研究中進步、成長?

在有分子生物技術之前,多是進行遺傳學或生理學的研究。很早以前,荷蘭的研究團隊就已經找到無法正常吸收硝酸鹽的阿拉伯芥突變株 (mutant),並開始研究它的生化特性,確認它就是硝酸鹽 (nitrate) 吸收壞掉的突變株,但當時因為沒有分子生物技術,而無法做進一步研究。

我常說,在我十歲的時候這個突變株就在了,可是因為沒有分子生物學的技術,而無法確知是哪個基因出問題導致它無法吸收硝酸鹽。

在 1990 年,分子生物技術剛建立起來,而我就利用這個工具去找。找到這個基因後,我們也開始做一些延伸性研究。由於在植物體內有另外 52 個基因和 CHL1 同屬一個蛋白家族,我們團隊也逐一地去了解它們的基因功能。經過數年研究,了解到植物是如何吸收硝酸鹽進來,而後送往地上部,又如何在不同環境下重新分配不同組織內的硝酸鹽。

我們發現,植物會想盡各種策略來確保年輕葉片有足夠的硝酸鹽,並且在開花結果後,植物也會把硝酸鹽輸送給種子做利用。

這樣一系列的反應都被研究出來後,就可了解硝酸鹽在植物中輸送的各種路徑。

小學跟中學常考的一個植物學考題是:根據教科書的教條,認為無機的氮源(例如硝酸鹽)只會在木質部中輸送,有機的氮源(例如胺基酸)才會在韌皮部篩管中輸送。但是,我們的研究發現教科書的教條需要修改,硝酸鹽可以在韌皮部篩管中輸送,而且這個輸送機制對植物的生長很重要。

另一部分,我也對蛋白質的調控感興趣。植物本身有兩種硝酸鹽的吸收系統,在土壤硝酸鹽含量很低時,負責作用的系統為「高親和性系統」;在土壤中的硝酸鹽含量很高時,負責作用的系統為「低親和性系統」。植物利用此兩個吸收系統去應對外界多變的硝酸鹽環境。

以前科學家都認為這是兩個獨立的系統,直到 2003 年我們實驗室的博士班學生劉坤祥研究發現:轉運蛋白 CHL1 可藉由磷酸化的轉換,感受到細胞外面的硝酸鹽濃度變化,來調節自身的吸收模式。

 

(左圖)當環境中硝酸鹽濃度較低時,CHL1 會因磷酸化,而成為高親和性的轉運蛋白。
(右圖)當硝酸鹽濃度較高時,CHL1則被去磷酸化,以轉換成低親和性的轉運蛋白。
資料來源│K.-H. Liu and Y.-F. Tsay*. (2003) Switching between the two action modes of the dual-affinity nitrate transporter CHL1 by phosphorylation.EMBO J.22:1005-1013.

這個研究告訴我們:植物有能力感應外界環境的硝酸鹽變化;不只是轉運蛋白會改變,植物也知道濃度低的時候省著點用、濃度高就貯存,因應變化來調控基因表現。這一系列反應很快,三十分鐘就會誘發基因表現。

我曾有一次聽植物鈣離子傳導的演講,演講者說:「實驗發現傷害植物的時候,鈣離子的訊息會增強。」所以會不會有可能當你吃生菜沙拉的時候,植物其實是會痛、有反應的?因為在自然界中,植物不能動,所以它對環境一定要有很好的偵測方法,還有因應策略。不管種子在哪裡發芽,都要想盡辦法在那個環境中存活下來。

過往普遍認知氮肥可幫助作物生長、提供產量,但近年發現氮肥會影響生態、也有食物殘留風險等,這如何能透過生物技術、研究來改善?

1950 年代的綠色革命發現氮肥可以讓產量翻倍,人口因此開始增加。原本的肥料是取自海鳥糞,後來找到了硝石礦,但仍是不足以應付需求,因此德國化學家弗里茨‧哈伯 (Fritz Haber)找到方法把氮氣轉換成植物能應用的形式。但氮氣的鍵結是很強的,要打斷鍵結要高溫高壓,是非常耗能的事,以至於全世界約有 1~2% 能源是花費在製造氮肥。

氮肥到土壤裡會被細菌轉換成硝酸鹽,但硝酸鹽不易保存在土壤中,下雨就會沖刷、進入到水循環。如此耗能生產的氮肥,施用下去田間,其實只有一半或少於一半能夠被植物利用。而湖川海洋中過多的硝酸鹽會造成優養化作用,形成藻華、Dead Zone,這其實是全球性的生態影響。

因此,我們希望想辦法解決這個問題,讓植物吸收硝酸鹽的效率好一點,進而減少環境的汙染、製造氮肥的能源消耗。

氮肥供應充足的時候,硝酸鹽養份主要會送往成熟葉;但在缺乏氮肥時,植物會把儲存在老葉的硝酸鹽運送到嫩葉。看到這種轉移的情況,我們就想:如果能夠強化這種轉移養分的機制,是不是就能夠加強氮肥的利用效率?

如下圖,我們研究發現,葉子中有一個 NRT1.7 基因有這個作用,如果能加強 NRT1.7 的基因表現,或是活化參與這個轉移機制的蛋白質活性,就可以提高植物利用氮肥的效率,進而促進植物生長。目前已經在阿拉伯芥實驗成功,也已取得臺灣和美國的專利,現在則是在水稻、菸草上進行試驗,這其實是個很漫長的過程,但一旦成功,對於生態環境是一大助益。

 

阿拉伯芥中,調控硝酸鹽吸收的基因 NRT1.11, NRT1.12 和 NRT1.7 ,透過不同路徑養護嫩葉。
資料來源│Ya-Yun Wang∗, Yu-Hsuan Cheng∗, Kuo-En Chen and Yi-Fang Tsay (2018) Nitrate Transport, Signaling, and Use Efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 69:27.1–27.38.、S.-C. Fan, C.-S. Lin, P.-K. Hsu, S.-H. Lin, and Y.-F. Tsay* (2009) The Arabidopsis Nitrate Transporter NRT1.7, Expressed in Phloem, Is Responsible for Source-to-Sink Remobilization of Nitrate. Plant Cell 21: 2750–2761.

對我來說,要一直用新的技術來回答新的問題,因為新的技術一定能夠讓問題的答案更深入,但我認為最重要的還是找到你要問的問題。而我最想問的問題是:植物是如何去處理它的養分,來做它最好的生長反應?研究過程中經常解決了一個問題後,還會有下個問題。

我一直喜歡植物研究的一個特色是,你可以從分子生物的尺度、到整株植物的生理去探索你的問題的答案,並發現這一切都相互呼應。

因為太專注於分子生物層面的東西,有時候是細微到只看到蛋白質的交互作用,但這樣細微作用如何影響到整個作物的生長,甚至是最後到農業的產量,這是我最感興趣的。

當初為何會投入植物、科學的研究?

我覺得投入研究的重點是「好奇」。你一定要有好奇心,會想追求一些新問題的答案。一名科學家必須要有好奇心,同時也需要有你的邏輯思考能力去尋求答案。

我大學是台大植物系的,會就讀植物系其實是個很浪漫的原因──只是因為我很喜歡植物而已。我喜歡走進森林的感覺,讓我很想去了解植物。

大四時,進到實驗室是做組織培養,那時候是很熱門的題目,因為很新奇。植物組織加入不同荷爾蒙,就會變成地上部的葉子或地下部的根,那是由於植物細胞有全能分化的能力。組織培養雖然有趣,但知其然不知其所以然,完全不知道是什麼原因造成這些變化,無法滿足我喜歡打破砂鍋問到底的個性,所以碩士就開始就往分子生物的領域走。不過因為那時植物的分生研究還沒發展起來,我就先從研究酵母菌開始,把分生基礎打好;等到讀完博士班,開始找研究題目、看論文時,發現仍是植物相關研究最能觸動我的神經,所以我就決定要再回去研究植物。

我覺得在科學的養成上,技術是一環,但邏輯思考的養成比技術的養成更難。邏輯思考的養成更要慢工出細活,很難一步到位。

看論文時,去找到這篇論文的核心價值是很重要的。做研究還要知道在這個領域中,最重要的問題是什麼。畢竟,找到問題後就是賭博了。要知道哪個方向的研究值得投資,要知道實驗資料和數據所代表的意義是什麼,如何解讀數據也是很重要的邏輯思考訓練,這些將都會成為你設計新的實驗時的依據。

其實,最辛苦的是剛開始設立自己的實驗室的時候。因為要訓練人,不是自己做就好,還要承擔所有的成敗。而且科學也是需要對外溝通,告訴資助單位、期刊還有大眾這個研究的重要性為何。

女性從事科學研究有多一層的考驗,因為社會對女性有許多的期許與要求,要兼顧家庭、事業兩方會是蠻大的挑戰。我覺得我算是蠻幸運,先生對我支持度也很高。在很多時候,女性碰到在家庭跟事業之間做抉擇時,會較容易放棄自己的事業。因此我常跟女學生說:對於家事能夠取得幫忙,就去取得,妳可以克服的,女性也可以顧全自己的事業。

  • 採訪編輯|江佩津
  • 美術編輯|張語辰